猪骨髓极小胚胎样干细胞的优化分选及生物学特性鉴定

发布时间：2017-05-20 10:23

  本文关键词：猪骨髓极小胚胎样干细胞的优化分选及生物学特性鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：联合采用免疫磁珠及流式细胞术分选猪骨髓极小胚胎样干细胞(VSELs);鉴定其生物学特性,并探寻体外培养、扩增猪骨髓VSELs的方法。方法：常规消毒、麻醉后穿刺猪髂后上棘获取骨髓,使用红细胞裂解法获得猪骨髓单个核细胞,运用分别耦合了CD133和Lin抗体的磁珠进行免疫磁珠分选,对所得的CD133+细胞群和Lin-细胞群标记荧光抗体CD133、CD45及Lin,进一步通过流式细胞术分选获得VSELs,使用统计学方法分析两种分选方法的效率,并探讨联合分选的价值；使用光学显微镜及透射电镜观察猪骨髓VSELs的形态特征和超微结构,运用碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色的方法鉴定其多能干细胞标志的表达；同时采用条件培养基对猪骨髓VSELs进行培养扩增,观察VSELs的贴壁及增殖情况。结果：联合采用免疫磁珠与流式细胞分选术能够高效的分选出猪骨髓VSELs,且使用CD133阳性分选较Lin阴性分选效率更高,但联合分选有费用高昂、细胞容易污染等缺点；猪骨髓VSELs约占总单个核细胞数量的0.01%-0.03%,该细胞体积较小、形态均一,呈二倍体核型、核大而细胞质少、核质比高,能够表达多能抗原标志Oct-4、Nanog和Sox2,同时碱性磷酸酶染色阳性；VSELs经条件培养基培养后3-4小时可见细胞贴壁,培养2-3周仍无明显增殖。结论：免疫磁珠及流式细胞术能够快速的从猪骨髓中分选出数量较多、纯度较高的VSELs；该细胞能表达胚胎样干细胞的特异性抗原标志,其生物学特性类似于胚胎干细胞,不易于体外培养、扩增。
【关键词】：优化分选 极小胚胎样干细胞 生物学特性 培养
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 英文缩写词表9-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 极小胚胎样干细胞简介12-16
• 2.1 概述12
• 2.2 VSELs的生物学特性12-16
• 2.2.1 VSELs的分离与纯化12-13
• 2.2.2 VSELs的起源与分布13-14
• 2.2.3 VSELs的细胞学特性14
• 2.2.4 VSELs的多向分化潜能14
• 2.2.5 VSELs的动员和归巢14-15
• 2.2.6 VSELs与肿瘤15
• 2.2.7 VSELs的体外扩增15-16
• 2.2.8 VSELs的应用前景16
• 第三章 材料与方法16-25
• 3.1 主要实验仪器与试剂16-20
• 3.1.1 实验动物16-17
• 3.1.2 主要实验仪器17
• 3.1.3 实验器械17
• 3.1.4 实验试剂及试剂配制17-20
• 3.1.4.1 实验试剂17-19
• 3.1.4.2 试剂配制19-20
• 3.2 实验方法20-25
• 3.2.1 猪骨髓总单个核细胞的分离20-21
• 3.2.1.1 红细胞裂解法分离猪骨髓单个核细胞20-21
• 3.2.1.2 密度梯度离心法分离猪骨髓单个核细胞21
• 3.2.2 MACS分选CD133+及Lin-细胞群21-22
• 3.2.2.1 CD133免疫磁珠阳性分选法21-22
• 3.2.2.2 Lin免疫磁珠阴性分选法22
• 3.2.3 FACS分选获得猪骨髓VSELs22-23
• 3.2.4 猪骨髓VSELs的体外培养23
• 3.2.5 碱性磷酸酶检测猪骨髓VSELs的活性23
• 3.2.6 细胞免疫化学鉴定猪骨髓VSELs23-24
• 3.2.7 透射电镜观察猪骨髓VSELs24
• 3.2.8 数据分析24-25
• 第四章 结果25-31
• 4.1 VSELs的形态特征及体外培养25-26
• 4.2 免疫磁珠分选效果26-28
• 4.3 流式分选28-29
• 4.4 透射电镜观察VSELs的超微结构29
• 4.5 碱性磷酸酶活性检测29-30
• 4.6 细胞免疫荧光检测30-31
• 第五章 讨论31-35
• 5.1 免疫磁珠联合流式细胞术优化分选的价值31-32
• 5.2 VSELs分选的注意事项32
• 5.3 Oct-4与VSELs的多向分化潜能32-33
• 5.4 VSELs保持静止的机制33
• 5.5 VSELs治疗心脏退行性疾病的优势33-34
• 5.6 面临的问题与展望34-35
• 第六章 结论35-36
• 参考文献36-40
• 综述40-49
• 参考文献46-49
• 致谢49-50
• 攻读学位期间发表的学术论文目录50-51

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本文编号：381382