蛴螬的活血化瘀作用及其机制初步研究

发布时间：2017-05-25 15:04

  本文关键词：蛴螬的活血化瘀作用及其机制初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景心血管疾病是目前医学上的一种多发病,严重威胁到患者的身心健康。近年来,由于生活水平的提高,同时也由于环境的恶化,血管疾病发病成上升趋势,并且成为目前中国人群的首要死因。血栓拴塞是心血管系统疾病的中常见的一类疾病,近年来严重危害人类健康,也是导致死亡率最高的原因之一,如心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓、脑拴塞、肺拴塞等。这些疾病都已经成为危害人类生命和健康的重大疾病。据不完全统计,在40岁以上人群中,心肌梗死的发生率每年为39.7/10万—64.0/10万,脑卒中发生率每年为109/10万。血凝和血栓形成是这一类疾病发病机制中涉及的重要的病理过程。因此,抗凝、预防血栓形成和将已形成的血栓溶解,已经成为当前临床上对血栓性疾病的重要的防治方法。目前抗血栓药主要包括抗凝血药、纤维蛋白溶解药和抗血小板药三大类。目前在临床上广泛应用的抗栓治疗药物多为尿激酶或者组织酶原激活剂,但是由于其价格昂贵,难以满足治疗和预防血栓病的需要。同时由于血栓拴塞性疾病的高发病率、高致残率和高死亡率,临床上迫切需要疗效高、毒副作用低的防治药物,而现有的药物均有不同程度的缺点。如尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等对于血栓栓塞性血管性疾病的溶栓治疗,“有效时间窗”短成为一主要问题,且此难题在国际也未得到解决。针对以上情况,不少医学同道尤其是中医、药界在这方面更是作出了艰辛的努力,虽然“中药溶栓”疗效目前还未得到医学界公认,但给人们提供了积极的启示。例如通过调整中药组方药物的选择、剂量的大小,配伍的原则和技巧,经过多年的摸索、临床验证,发现其“有效时间窗”比溶栓西药延长了,从实践中看到了“中药溶栓”的曙光。昆虫来源的药物资源丰富,目前昆虫来源的活性蛋白质、多肽的研究已经成为研究的一个新热点。蛴螬,学名为东北大黑鳃金龟幼虫,主要功效为破瘀、散结、止痛、解毒,作为一味中药在中医上有多种应用,可以治疗破伤风、目中翳障、小儿丹毒等。另外,也有关于蛴螬用于活血化瘀的记载。《长沙药解》中记载：蛴螬,能化瘀血,最消块。《纲目》：蛴螬,《本事方》治筋急,养血地黄丸中用之,取其治血瘀痹也。由此可见,蛴螬为行血化瘀的良药。但是由于现代医学对蛴螬活性组分的研究极其贫乏,活血化淤的机制也不明确,极大的限制了蛴螬在活血化淤方面的使用。我们从蛴螬肠腔内容物中获取了其粗提取物,在下文中简称"CEHDL",尝试从西医药理的抗凝溶栓角度来证实蛴螬的“活血化瘀”作用,并探索其抗凝溶栓机制及其活性组分的性质。目的1.从西医药理的抗凝溶栓角度来阐述蛴螬的活血化瘀作用2.探索蛴螬提取物抗凝溶栓的机制3.初步鉴定蛴螬活血化瘀活性物质的性质方法1.大鼠血浆复钙化时间检测蛴螬提取物体外抗凝活性从SD大鼠腹主动脉取血并获得贫血小板血浆,分别与阴性对照组生理盐水,蛴螬提取物四个剂量组(12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)混匀于37℃水浴孵育5分钟,然后再加入氯化钙溶液(25mM)并摇匀,记录从加入氯化钙至液面凝固为止的时间,即为血浆复钙化时间。2.小鼠尾静脉出血时间检测蛴螬提取物体内抗凝活性将30只昆明小鼠随机分为5组。分好组后,每组内小鼠尾静脉注射生理盐水,三个浓度的蛴螬提取物(10μg/g,20μg/g,50μg/g),以及尿激酶。2小时过后,剪断小鼠尾静脉尾端5 mm,测定每组小鼠尾静脉出血时间。3.体外血凝块的溶解实验检测蛴螬提取物溶栓活性麻醉新西兰家兔,心脏取血后待其自然凝固成血凝块,然后将血凝块分成大致相等的小份血凝块,分为5组,每组血凝块分别与阴性对照生理盐水,蛴螬提取物三个浓度组(200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml),尿激酶(100 u/m1)孵育。用倒置显微镜观察每组溶液上清中因为血栓溶解释放出的红细胞数量,并拍照。12 h后,再分别根据血凝块初始重量和末重之差来计算每组的溶栓率。4.卡拉胶诱导的血栓模型检测蛴螬提取物抗小鼠尾静脉血栓作用将32只昆明小鼠随机分为4组,首先分别给予每组小鼠尾静脉注射生理盐水,两个浓度的蛴螬提取物(20μg/g, 50μg/g),以及尿激酶。2h后,注射0.1%的角叉菜胶诱导尾静脉血栓形成。24小时过后,统计每组小鼠尾静脉血栓发生率,同时用卡尺测量每组内发生血栓的小鼠尾静脉血栓长度,以观察蛴螬提取物对小鼠尾静脉血栓的影响。5.测定蛴螬提取物对纤维蛋白原的降解作用通过SDS-PAGE凝胶电泳,观测不同浓度的蛴螬提取物对纤维蛋白原的降解作用,以及降解纤维蛋白原的三个亚基的顺序6.测定蛴螬提取物对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用大鼠心脏采血后用离心的方法获得贫血小板血浆和富血小板血浆,用血小板聚集仪测定富血小板血浆中加入不同浓度的蛴螬提取物时的聚集曲线,并计算其对5 min内对最大聚集率的抑制率。7.测定蛴螬提取物对纤维蛋白的降解作用及其降解方式用琼脂糖做载体,用凝血酶激活纤维蛋白原变成纤维蛋白,制作成琼脂糖纤维蛋白平板,再于85℃烘箱中烘烤30 min,制成灭活平板。在做好的纤维蛋白平板上打孔加入样品,根据加样孔周围有无溶圈形成及比较溶圈大小来判断蛴螬提取物对纤维蛋白的降解作用及降解方式。8.蛴螬提取物的初步分离纯化及纤溶活性物质性质鉴定蛴螬提取物的S-100HR分离纯化后,通过与纤维蛋白原反应后进行凝胶电泳以检测纤溶活性峰；通过观察蛴螬提取物与分离材料DEAE sephadex-A50, CM Sephadex-C50的结合判定其中纤溶活性物质为阴离子还是阳离型；用Molish反应鉴定蛴螬提取物中是否含糖类。9.测定蛴螬提取物纤溶活性的影响因素通过SDS-PAGE凝胶电泳,观测温度、pH、金属离子以及蛋白酶抑制剂对其纤溶活性的影响。实验结果1.当蛴螬提取物在血浆中的浓度达到25μg/mL以上时,可以明显延长血浆复钙化时间,而且延长效果随着蛴螬提取物浓度的增加而增加,说明其具有良好的体外抗凝活性。2.小鼠尾静脉出血时间实验表明,给予小鼠注射蛴螬提取物后,与阴性对照比较,可以明显延长小鼠尾静脉出血时间,说明其具有良好的体内抗凝活性。3.在蛴螬提取物对血液形成的体外血凝块的溶解实验中,随着蛴螬提取物浓度的升高,因为溶解血凝块而释放出来的血红细胞数量明显成增多趋势,而且在12h后,测定的实验组的血凝块溶解率也明显高于阴性对照组,这表明蛴螬提取物可以溶解体外血凝块,也说明其具有良好的体外溶栓活性。4.蛴螬提取物可以明显的降低角叉菜胶诱导小鼠尾静脉血栓发生率,同时可减短小鼠尾部血栓长度,说明其具有良好的体内抗血栓活性。5.凝胶电泳实验表明,蛴螬提取物可以降解纤维蛋白原,而且对与纤维蛋白原三个亚基均有降解作用,同时对于三个亚基的降解顺序依次为α→β→γ,推测蛴螬提取物通过降解纤维蛋白原发挥抗凝作用。6.蛴螬提取物可以轻度抑制ADP诱导的大鼠血浆聚集7.在灭活纤维蛋白平板试验中结果显示,蛴螬提取物周围形成溶圈,表明蛴螬提取物自身可以降解纤维蛋白,并且降解作用也是随着浓度的增加而增加,但蛴螬提取物不能激活纤溶酶原,因此蛴螬提取物是通过自身降解纤维蛋白而发挥溶栓作用。8.蛴螬提取物纤溶性物质经S-100HR分离纯化后在Ⅱ峰,纤溶性物质为阴离子型,且不含糖类。9.蛴螬提取物纤溶活性物质在75℃以上失活,说明为蛋白酶类,并且其纤溶活性可以被丝氨酸蛋白酶抑制剂部分抑制,EDTA对其纤溶活性无影响,说明其纤溶活性成分含有丝氨酸蛋白酶但不含金属蛋白酶：并且其在(pH3.0～pH10.0)范围内均能保持活性,而且各种金属离子(Mg2+,Ca2+,Zn2+,Fe2+ Fe2+, Cu2+)对其纤溶活性几乎无影响。结论1.蛴螬提取物可以延长血浆复钙化时间和小鼠尾静脉出血时间,同时可以溶解体外血凝块,这说明其具有良好的抗凝和溶栓活性,从而达到活血化瘀功效。2.蛴螬提取物主要通过降解纤维蛋白原和直接降解纤维蛋白而发挥抗凝溶栓的作用。其对纤维蛋白原的三条链均有降解作用,并且降解顺序为α→β→γ；但不能激活纤溶酶原而是通过直接降解纤维蛋白而发挥溶栓作用。3.蛴螬的纤溶活性物质含有丝氨酸蛋白酶但不含金属蛋白酶,常见金属离子和pH (pH3.0～pH10.0)对其纤溶活性影响较小。
【关键词】：蛴螬 抗凝溶栓 纤维蛋白原
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-28
• 第一章 蛴螬提取物体内外抗凝溶栓效果评价28-42
• 一、实验材料及仪器28-29
• 二、实验方法29-32
• 三、实验结果32-42
• 第二章 蛴螬提取物抗凝溶栓的机制研究42-52
• 一、实验材料及设备42-43
• 二、实验方法43-45
• 三、实验结果45-52
• 第三章 蛴螬提取物纤溶性成分性质鉴定52-66
• 一、实验材料及仪器52-53
• 二、实验方法53-56
• 三、实验结果56-66
• 第四章 讨论66-71
• 结论71-72
• 参考文献72-77
• 论文发表情况77-78
• 缩写词中英文对照表78-79
• 致谢79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 阚飞;孙捷;田路e

本文编号：394088