脚桥核低频电刺激影响6-OHDA帕金森大鼠的步态和丘脑腹外侧核神经递质水平

发布时间：2017-05-25 14:20

  本文关键词：脚桥核低频电刺激影响6-OHDA帕金森大鼠的步态和丘脑腹外侧核神经递质水平，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中枢神经系统渐进性神经退行性疾病。该病以中脑黑质多巴胺能神经元变性为主要病理特征,常发病于中老年人。统计学显示,在65岁以上老年人中,PD患病率大于1%,严重影响老年人的生活。临床上PD主要表现为肢体静止性震颤、僵直、运动迟缓等运动功能失调,在疾病晚期还将出现步态困难和姿势不稳(postural instability and gait difficulty, PIGD)等轴性症状。该症状常常是导致患者致残的主要原因。临床上,治疗帕金森病的主要方法有内科药物和外科手术治疗。其中外科手术治疗是在左旋多巴(levodapa, L-dopa)应用之前发展起来,并且近年来再次兴起的治疗药物难治性晚期PD患者运动并发症的手段。早期的手术方式主要是立体定向损毁脑深部神经核团,包括苍白球内侧部(globus pallidus internus, GPi)、丘脑(丘脑腹部中间核,ventral intermediate nucleus, Vim)和丘脑底核(subthalamic nucleus, STN)。立体定向脑深部电刺激术(deep brain stimulation, DBS)是相对损毁术的一种可调控和可逆的替代手段。该手术通过立体定向将刺激电极植入特定的深部脑神经核团,对核团进行刺激,调节引起症状的异常电活动,从而改善患者的症状。目前DBS已成为治疗晚期PD患者最佳的外科方法,尤其对药物难治性PD能取得显著的临床治疗效果。尽管Vim-DBS可有效改善PD患者的震颤；GPi-DBS可有效改善PD患者对侧肢体的震颤、强直、运动迟缓；STN-DBS对肌强直、运动迟缓、震颤均有效,但是以上治疗方式对晚期PIGD疗效欠佳。近来研究发现,PIGD和脚桥核(pedunculopontine nucleus, PPN)功能失调有关,目前PPN已被推荐为治疗PIGD的潜在目标核团。然而对于低频刺激PPN对PD大鼠步态方面的作用的报道甚少。CatWalk是一种啮齿类动物自动步态检测系统,能够客观量化自发运动期间动物的动、静态步态参数。CatWalk方法已被用于评估了一系列动物模型的步态参数,如疼痛和脊柱损伤模型。尽管研究者对PPN的兴趣正在逐步增加,PPN-DBS治疗PIGD的作用机制目前是不清楚的。实际上我们认为探索PPN-DBS对PD状态下运动丘脑(大鼠主要包括ventrolateral and Ventroanterior thalamus nuclei,VA/VL)神经递质水平的影响,对近一步理解其治疗轴性症状的机制可能是重要的。理由如下：1.PPN主要由胆碱能、谷氨酸和氨基丁酸能神经元组成。PD病人和PD动物模型PPN存在胆碱能神经元丢失。且胆碱能神经元丢失被认为与PD的PIGD相关。2.基底前脑主要由胆碱能神经元组成,接受PPN的胆碱能投射,也存在变性。3.PPN和基底前脑均发送胆碱能纤维到运动丘脑。4.运动丘脑与大脑皮层多个区域存在纤维联系,在整合基底节、小脑和皮层运动相关信息方面发挥着重要作用。5.蓝斑主要由去甲肾上腺素能神经元组成,PD病人和动物模型存在蓝斑变性。基于上面所述,首先,评估PPN-DBS能否在PD动物模型上(如大鼠)改善步态,有助于我们进一步理解PPN-DBS的行为学作用。其次,与PIGD相关的几个脑组织结构均与运动丘脑存在联系,而运动丘脑被认为参与运动相关信息的整合。它的异常状态可能涉及到PIGD。因此研究PPN-DBS与运动丘脑内相关神经递质水平的关系,可能对理解PPN-DBS改善PIGD的作用机制是至关重要的。目的通过CatWalk步态分析系统评估偏侧6-OHDA损毁PD大鼠的步态,并分析低频刺激PPN对PD大鼠步态的影响,从而进一步理解PPN-DBS在PD啮齿动物模型上的行为学作用；探索PPN-DBS对偏侧PD大鼠运动丘脑(本实验位于VL亚区)神经递质水平的影响,以加深理解PPN-DBS改善PIGD的潜在机制。当前实验主要探索VL内谷氨酸(glutamic acid, Glu),7-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, y-GABA),乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)和去甲肾上腺素(noradrenalin, NA)水平。方法1.实验分组SPF级成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠38只(重280-320g),随机分为三组。A组,假损毁组(n=10),右侧前脑内侧纵束(medial forebrain bundle, MFB)立体定向注射4μl生理盐水；B组,损毁组(n=14),右侧MFB注射4μl6-OHDA; C组,损毁+电极组(n=14),右侧MFB注射4μl(3μg/μl) 6-OHDA,并且在右侧PPN植入微电极。所有大鼠在VL区域接受微透析探针导管植入。2.使用CatWalk采集大鼠步态参数基线值：在立体定向手术前,所有大鼠进行Catwalk适应性训练1周。训练方法：将大鼠置入Catwalk通道,训练其自发连续不停顿地通过通道,每只大鼠早晚各训练一次,每次来回跑过通道至少5次,达到训练合格的大鼠给予食物奖赏,整个训练在安静暗室中完成。训练合格标准为：大鼠需连续不停顿地通过通道,次数至少5次。训练结束后,在接下来的两天,采集所有大鼠Catwalk步态数据作为基线值。3.立体定向手术手术1,A组,即假手术组的大鼠麻醉后固定在立体定向仪上,齿杆低于耳杆3.4mm,根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》确定右侧前脑内侧纵束(MFB)坐标：前囟后2.0mm,旁开2.0mm,硬膜下8.0mm。在预定坐标位置缓慢注射4ul含0.02%抗坏血酸的生理盐水。B组和C组大鼠注射12ug/4ul的6-OHDA溶液(用含有0.02%抗坏血酸的生理盐水溶解)。手术2,两周后,B组和C组大鼠再次麻醉,头部固定于立体定向仪,齿杆低于耳杆3.4mm,确定VL坐标：前囟后2.28mm,旁开2.4mm,硬膜下5.4mm。在坐标点植入微透析导管。同时确定PPN坐标：前囟后7.9mm,旁开2.1mm,硬膜下7.0mm。C组大鼠然后按坐标缓慢植入微电极。大鼠术后进行1周恢复。4.采集步态参数在采集前,按照上述方法再次用CatWalk训练大鼠5天,加强记忆。随后两天,采集所有大鼠步态,4次厌,每只大鼠每次通过跑道不少于5次。C组的大鼠在跑前15分钟进行电刺激,随后5分钟放入跑道测试,同时进行电刺激。5.电刺激程序测试每只大鼠的刺激阈值。方法：调到频率25Hz,脉宽80us,然后从20μA电流开始,逐步调高电流,每次5μA,进行刺激,观察大鼠的反应,若出现大鼠身体扭转至一侧或者头部抖动,此时的电流强度确定为该大鼠的阈值。正式刺激时采用低于阈值20gA的电流,25Hz频率和80μs脉宽刺激。在装电极的大鼠,分别测试通电刺激和未通电状态的步态。6.微透析程序探针的激活：(1)将探针固定于支架上,用人工脑脊液灌注各部分以排空气泡。在连接探针时,探针出口端所接的管不应太长(约5cm),否则压力大使薄膜胀气。(2)首次使用时将探针、连接管和适配器浸泡于70%酒精中5-10min,并以1ul/min速度灌注70%酒精至少1h,流速不可大于10μl/min。以人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)取代70%酒精以1μl/min速度至少灌注1h。样品收集：每30min收集一次样本,弃去前面2小时的样本,然后收集两个基线样本,(C组刺激20min)之后再收集6个样本。样品收集完成后放入-80度冰箱。待检。回收率测定：将探针浸泡到含标准品浓度为0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm的人工脑脊液里,用不含标品的人工脑脊液以2ul/min灌流,每个浓度收集四次,收集量为40ul。回收率r=C收集/C脑脊液*100%。7.液相和液质方法：(1)液相测定谷氨酸和γ-氨基丁酸：Hypersil ODS色谱柱,4.0mm×125mm,粒径5Lm；流动相(A)：10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 PH7.2磷酸缓冲液(phosphate buffer, PB),含0.5%四氢呋喃(THF)；流动相(B)：PB-甲醇-乙腈(体积比50：35：15)。线性梯度：在0-25 min内,流动相B以线性从0%上升到100%；流速：1.0mL/min;柱温40℃；检测波长：0 min时,激发波长340 nm,发射波长450 nm,20.5 min后,将波长切换至激发波长260 nm,发射波长305 nm。8.液质测定ACh和NA方法乙酰胆碱Ach质谱条件：母离子：146.1；子离子：87.1 (CE 12),60.2 (CE 8); Fr:72;电喷雾离子源ESI；正离子MRM模式。去甲肾上腺素NA质谱条件：母离子：170；子离子：152.1 (CE 4),107 (CE 17); Fr:40;电喷雾离子源ESI；正离子MRM模式。色谱条件：色谱柱：C-18柱2.1mm×50mm,1.8μm流动相：A：乙腈；B：5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸梯度洗脱条件：0～2 min,100%B,2～2.4 min,100%～20%B,2.4～2.6 min, 20%～100% B,2.7～5.0 min,100%B流速:0.3 mL/min9.组织化学：全部实验结束后,大鼠常规麻醉,给予电刺激30s(30μA),使得电极尖端在脑组织上留下针道痕迹。开胸心脏灌注生理盐水,再灌注4%多聚甲醛溶液固定(含1%的氰铁化钾),取脑组织置于4%多聚甲醛浸泡固定过夜,再置于25%蔗糖溶液中脱水。冰冻切片后,取PPN和VL部行尼氏染色以确定电极和微透析探针位置。黑质致密处的切片行TH免疫组化染色。10.统计学方法：采用SPSS19.0统计软件分析数据,计量资料用“均数±标准误”表示。多组均数间的比较采用one-way ANOVA检验；同一组个体PPN-DBS刺激和非刺激状况的均数比较采用配对样本t检验,以P0.05为差异有统计学意义。结果：1.步态测试结果：与假手术组相比,6.OHDA损毁组大鼠显示出增加的步态基数(base of support,BOS,后肢)；减少的步幅(stride)、最大接触面积和强度(左前肢)(P0.05)。与刺激前相比,低频刺激PPN明显改善BOS和最大接触面积(P0.05),对其他参数没有影响。2.神经递质结果：与假手术组相比,6.OHDA损毁大鼠Glu和γ-GABA水平显著升高,ACh水平明显降低(P0.05),NA无变化。与刺激前相比,低频刺激PPN明显改善Glu浓度(P0.05),轻微改善ACh浓度,对其他参数无影响。结论：本研究展示低频刺激PPN能够改善PD大鼠部分步态缺陷,支持低频刺激PPN能够改善PD步态缺陷的建议；本研究也显示低频刺激PPN再平衡PPN-VL通路上Glu和ACh浓度,该现象提供了PD中PIGD潜在机制的一个可能的视角。
【关键词】：帕金森病 深部脑刺激 catwalk 步态 微透析 神经递质 大鼠
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-22
• 第二章 材料与方法22-34
• 2.1 实验材料22-26
• 2.2 实验方法26-34
• 第三章 结果34-41
• 3.1 大鼠的剔除情况34
• 3.2 免疫组化染色结果(Fig 5)34-35
• 3.3 尼氏染色结果35
• 3.4 大鼠自动步态检测结果(Fig 8)35-37
• 3.5 大鼠神经递质检测质谱图37-38
• 3.6 大鼠神经递质检测结果(Fig 11、12)38-41
• 第四章 讨论41-46
• 4.1 低频刺激PPN的行为学效应41-43
• 4.2 低频刺激PPN对神经递质的效应43-45
• 4.3 技术说明45-46
• 第五章 结论46-47
• 参考文献47-53
• 综述53-79
• 参考文献66-79
• 中英文缩略词对照表79-80
• 攻读硕士期间的研究成果80-81
• 致谢81-82

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 陈志晔;李金锋;刘梦雨;马林;;2型糖尿病患者脑部皮层及皮层下奖赏环路研究[J];南方医科大学学报;2013年09期

2 乔德才;王梦羽;侯莉娟;刘晓莉;;运动疲劳大鼠丘脑腹外侧核神经元自发放电特征的分析[J];北京师范大学学报(自然科学版);2015年03期

3 Xin Wang;Meihao Wang;Weizhuo Wang;Huiru Liu;Jiejie Tao;Chuang Yang;Jiance Li;;Resting state brain default network in patients with motor aphasia resulting from cerebral infarction[J];Chinese Science Bulletin;2014年31期

4 胡琰茹;刘晓莉;乔德才;;大鼠在力竭运动中“黑质-丘脑-皮层”通路的调控作用[J];上海体育学院学报;2013年05期

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1 田均;苍白球外侧部在异常不自主运动产生中的作用研究[D];浙江大学;2013年

2 张瑞国;喹硫平干预对PCP诱导的大鼠精神分裂症样行为及髓鞘异常的影响的研究[D];第四军医大学;2012年

3 王雅琴;帕金森病认知功能障碍及遗传易感性研究[D];中南大学;2014年

4 侯景明;脊髓损伤后脑结构和功能改变的多模态磁共振研究[D];第三军医大学;2015年

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1 胡晓飞;帕金森病患者的脑结构及功能多模态磁共振成像研究[D];第三军医大学;2013年

2 彭爱军;CRRCAE软件的研发及其在左基底节区脑出血失语评定中的应用[D];扬州大学;2014年

3 申玮;脊髓小脑性共济失调3型（SCA3/MJD）患者静息态功能磁共振成像研究[D];中南大学;2014年

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本文编号：394014