MicroRNA-126对大鼠胰岛β细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制

发布时间：2017-06-01 20:01

  本文关键词：MicroRNA-126对大鼠胰岛β细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:优化SD大鼠胰岛β细胞的分离、纯化和培养的方法与条件,为研究micro RNA-126(mi R-126)在2型糖尿病发病中的作用与机制提供活性与功能良好的胰岛β细胞。方法:SD大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉,经胆总管逆行灌注采用8m L胶原酶Ⅴ(1mg/m L含DNase I 100U)、原位消化后Hitopaque-1077梯度离心分离纯化胰岛细胞并作培养,再将培养后的胰岛细胞用胰蛋白酶消化使其分散成单个的β细胞后对其进行培养。结果:每只大鼠用上述方法可分离、纯化得到胰岛细胞372±45个,胰岛细胞纯度大于90%,胰岛细胞存活率大于95%。结论:胆总管逆行灌注胶原酶Ⅴ(含DNase I 100U)原位消化分离胰岛细胞,可有效避免胰腺胶状物质的产生,提高胰岛细胞的收获量与实验成功率;Hitopque-1077梯度离心纯化胰岛细胞的方法具有操作简单、便捷、经济等优点,纯化得到的胰岛细胞纯度与存活率高,功能活性强;使用改良后DMEM高糖培养液(15%FBS,50μmol/Lβ-巯基乙醇,10 mmol/L HEPES)培养的胰岛β细胞形态完整,活力强,适宜用于胰岛β细胞培养。研究背景:随着人类生活方式与生存环境的改变,糖尿病患者逐年增多,临床90%以上的糖尿病患者为2型糖尿病,胰岛素抵抗是2型糖尿病的发病基础。本课题前期研究发现,mi R-126对胰岛素信号通路有一定调控作用,mi R-126与胰岛素抵抗存在一定的联系。为了进一步探究mi R-126在胰岛素信号通路中的调控作用及其对胰岛β细胞凋亡的影响,我们建立了一个可靠的原代培养的大鼠胰岛β细胞模型。目的:本研究旨在探讨mi R-126在原代分离培养的正常SD大鼠胰岛β细胞胰岛素信号通路中的调控作用及其对胰岛β细胞凋亡的影响。方法:以原代分离培养的正常SD大鼠胰岛β细胞为模型,转染合成的mi R-126模拟物(mi R-126 mimic)或mi R-126抑制剂(mi R-126 inhibitor),干预mi R-126的表达,并用流式细胞术检测转染效率和细胞凋亡率。转染后的大鼠胰岛β细胞用胰岛素(100nm)刺激12小时,提取细胞的总RNA,用荧光定量PCR技术以U6及β-actin为内参基因检测mi R-126、IRS-1、IRS-2的相对表达量;提取细胞总蛋白进行BCA蛋白测定,用western Blot技术检测IRS-1/2,Akt,PIK3R2蛋白表达量。结果:流式细胞术检测显示:mi R-126 mimics、mi R-126 inhibitor、negative control转染效率较高;mi R-126 mimic组大鼠胰岛β细胞凋亡数显著高于NC组和mi R-126inhibitor组(P0.05);荧光定量PCR检测结果显示:mi R-126 mimic组大鼠胰岛β细胞IRS-1/2相对表达量较NC组和mi R-126 inhibitor组显著降低(P0.05);Western blot结果显示:mi R-126 mimic组大鼠胰岛β细胞IRS-1/2、Akt、P-Akt及PIK3R2蛋白表显著受到抑制。结论:1.过表达mi R-126可能通过调控胰岛素信号通路中IRS-1/2、Akt、P-Akt及PIK3R2表达参与胰岛素抵抗。2.过表达mi R-126可诱导大鼠胰岛β细胞凋亡。
【关键词】：胰岛细胞 分离 纯化 培养 Hitopque-1077 梯度离心 micro RNA-126 胰岛素信号通路 大鼠胰岛β细胞 2型糖尿病 细胞凋亡
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 第一部分 大鼠胰岛β细胞分离及纯化4-6
• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 第二部分 Micro RNA-126 对大鼠胰岛β细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制6-10
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文缩写及英汉全称（Abbreviation）10-12
• 第一部分SD大鼠胰岛β细胞分离及纯化12-29
• 前言12-14
• 材料和方法14-22
• 1. 材料14-16
• 2. 实验方法16-22
• 结果22-26
• 讨论26-28
• 结论28-29
• 第二部分Micro RNA对大鼠胰岛β细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制29-56
• 前言29-32
• 材料与方法32-45
• 1. 材料32-35
• 2. 实验方法35-44
• 3. 统计学方法44-45
• 结果45-53
• 讨论53-55
• 结论55-56
• 参考文献56-60
• 综述60-67
• 参考文献64-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间科研成果68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 陆忠;沈水仙;支涤静;罗飞宏;;大鼠胰岛分离纯化新方法“两步过筛法”的建立及评估[J];中国当代儿科杂志;2013年07期

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本文编号：413340