牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及其机制研究

发布时间：2017-07-03 05:09

  本文关键词：牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及其机制研究

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【摘要】：脑血管病已成为当今世界致死致残的最主要疾病之一。目前对于脑缺血的治疗效果均不能令人满意。临床上急需寻找高效低毒、促使血液再通、减轻缺血再灌致脑损伤的神经保护剂。牡荆苷是传统中药金莲花的主要活性成分,属黄酮碳苷类。课题组研究表明牡荆苷具有很好的体内抗氧化和对衰老小鼠海马区神经细胞结构的保护作用。而牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用方面的研究尚未见报道,本实验以SD雄性大鼠为实验对象,采用Longa改良线栓法制造大鼠脑缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,以牡荆苷为干预药,依达拉奉为阳性对照,研究牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用并探讨其作用机制。本研究为牡荆苷作为预防和治疗脑血管病有效性药物提供可靠的实验依据,为筛选抗脑缺血药物提供新的方向。实验方法1.MCAO模型的建立采用Longa线栓法造模,缺血2h后进行再灌注,待大鼠苏醒后进行神经行为学评分,验证造模成功。2.动物分组及给药将228只SD大鼠随机分为6个组,分别是假手术组(生理盐水+溶剂),模型组(生理盐水+溶剂),模型+依达拉奉阳性对照组(3.24μmol·kg-1),模型+牡荆苷(1.62,3.24,6.48μmol·kg-1)不同剂量组,大鼠缺血再灌注后1h腹腔注射给药,治疗时间为1d和3d。3.牡荆苷对MCAO大鼠脑梗死体积的影响缺血再灌注大鼠治疗1d后麻醉,断头取脑,冠状位将其切成5等份,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(toronto transit commission,TTC)测定大鼠脑梗死体积。4.牡荆苷对mcao大鼠血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb)保护和抗氧化作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取脑,干湿重法测定脑组织含水量;免疫组化法检测大鼠缺血侧皮层水孔通道蛋白-4(aquaporin-4,aqp-4)阳性细胞表达水平;相应试剂盒检测超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活力、活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)和丙二醛(malondialdehyde,mda)含量。5.牡荆苷对mcao大鼠抗炎作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取脑,免疫组化法检测大鼠缺血侧皮层toll样受体4(tolllikereceptor4,tlr-4),nf-κb(p65)阳性细胞表达水平;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-timequantitativepolymerasechainreaction,rt-qpcr)检测tlr-4mrna,nf-κb(p65)mrna的表达;酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)测定大鼠缺血侧脑组织肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)。6.牡荆苷对mcao大鼠非抗氧化作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取缺血侧脑组织,相应试剂盒检测一氧化氮(nitricoxide,no)含量和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,nos),na+-k+-atp酶活性;氨基酸自动分析仪测定脑组织缺血区谷氨酸(glutamate,glu),天冬氨酸(aspartate,asp)和甘氨酸(glycine,gly)含量。7.牡荆苷对mcao大鼠脑组织缺血区形态学作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取脑,he染色观察大鼠缺血区神经细胞形态;透射电镜下观察大鼠缺血区神经元细胞超微结构。结果1.mcao大鼠神经功能学评分依据longa等评分标准,选取1~3分为实验模型大鼠。与假手术组相比,缺血再灌注大鼠出现不能完全伸展手术对侧前爪或向手术对侧转圈、倾倒等神经缺损症状(p0.01),表明mcao模型制作成功。2.牡荆苷减少mcao大鼠脑梗塞体积与假手术组相比,模型组大鼠再灌注后缺血侧脑组织出现明显的梗死灶(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d后,依达拉奉和牡荆苷各给药组均能有效减小脑梗死体积,并在一定剂量范围内,具有剂量依赖性(p0.01,p0.05);与依达拉奉对照组相比,牡荆苷中、低剂量组作用较弱(p0.01,p0.05);牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异。3.牡荆苷对mcao大鼠bbb及抗氧化作用影响3.1牡荆苷减轻mcao大鼠脑水肿程度与假手术组相比,大鼠脑缺血再灌注后,缺血侧脑组织含水量明显增多(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组均能降低脑组织含水量,有显著性差异,(p0.01,p0.05)且呈剂量依赖性;与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组作用较弱,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异;与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组降低脑水肿程度优于1d,有显著性差异(p0.05,p0.01)。3.2牡荆苷降低mcao大鼠aqp-4表达与假手术组相比,模型组大鼠缺血区脑组织aqp-4阳性细胞表达明显增多(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组均能使aqp-4阳性细胞表达下降(p0.05,p0.01),且呈剂量依赖性;与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组作用较弱,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异;与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组下调aqp-4阳性细胞表达程度优于1d,有显著性差异(p0.05,p0.01)。3.3牡荆苷可增加mcao大鼠sod活性,降低ros、mda含量与假手术组相比,模型组大鼠sod活性降低,ros和mda含量升高,均有显著性差异(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组均能使sod活性升高,ros和mda含量降低,且呈剂量依赖性(p0.05,p0.01);与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组在保护sod活性、降低ros和mda含量上弱于依达拉奉对照组,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异:与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组在保护sod活性、降低ros和mda含量上优于1d,具有显著性差异(p0.05,p0.01)。4.牡荆苷对mcao大鼠抗炎作用4.1牡荆苷减少缺血侧皮层tlr-4和nf-κb阳性细胞数与假手术组相比,模型组大鼠缺血区脑组织tlr-4与nf-κb(p65)阳性细胞表达明显增多(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组均能使tlr-4和nf-κb(p65)阳性细胞表达下降(p0.05,p0.01),且呈剂量依赖性;与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组作用较弱,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异;与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组下调tlr-4和nf-κb(p65)阳性细胞表达程度优于1d,有显著性差异(p0.05,p0.01)。4.2牡荆苷减少缺血区脑卒中tlr-4和nf-κb(p65)mrna的表达与假手术组相比,模型组大鼠缺血区脑组织tlr-4和nf-κb(p65)mrna表达明显升高(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组均能降低tlr-4和nf-κb(p65)mrna表达,且呈剂量依赖性(p0.05,p0.01);与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组在降低tlr-4和nf-κb(p65)mrna表达上弱于依达拉奉对照组,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异;与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组在降低tlr-4和nf-κb(p65)mrna表达上优于1d,有显著性差异(p0.05,p0.01)。4.3牡荆苷减少大鼠缺血区脑组织tnf-α含量与假手术组相比,模型组大鼠tnf-α含量明显升高,有显著性差异(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组给药后,tnf-α含量有所降低,且呈剂量依赖性(p0.05,p0.01);与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组在降低tnf-α含量上弱于依达拉奉对照组,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异:与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组在降低tnf-α含量上优于1d,具有显著性差异(p0.05,p0.01)。5.牡荆苷对mcao大鼠非抗氧化作用5.1牡荆苷降低no含量、抑制nos活性与假手术组相比,模型组大鼠no含量及nos活性明显升高,均有显著性差异(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组给药后,no含量及nos活性降低,且呈剂量依赖性(p0.05,p0.01);与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组在降低no含量及抑制nos活性上弱于依达拉奉对照组,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异:与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组在降低no含量及抑制nos活性上优于1d,有显著性差异(p0.05,p0.01)。5.2牡荆苷增强na+-k+-atp酶活性与假手术组相比,模型组大鼠na+-k+-atp酶活性明显降低,有显著性差异(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组给药后,na+-k+-atp酶活性有所升高,且呈剂量依赖性(p0.05,p0.01);与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组在提高na+-k+-atp酶活性上弱于依达拉奉对照组,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异:与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组在提高na+-k+-atp酶活性上优于1d,具有显著性差异(p0.05,p0.01)。5.3牡荆苷可降低脑组织中兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacid,eaa)含量,增加抑制性氨基酸(inhibitoryaminoacid,iaa)含量与假手术组相比,模型组大鼠asp,glu含量明显升高,gly含量明显降低,均有显著性差异(p0.01);与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组给药后,asp,glu含量有所降低,gly含量有所升高,具有显著性差异,且呈剂量依赖性(p0.05,p0.01);与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组在降低asp,glu含量,提高gly含量弱于依达拉奉对照组,有显著性差异(p0.05,p0.01),牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异;与缺血再灌注大鼠治疗1d相比,治疗3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组在降低asp,glu和升高gly含量上优于1d,具有显著性差异(p0.05,p0.01)。6.牡荆苷对大鼠缺血区神经细胞形态影响he结果显示,假手术组细胞形态正常,排列整齐,模型组细胞体积缩小、核固缩深染。各给药组均能改善细胞病理形态。且在一定给药剂量范围内,随着牡荆苷给药浓度的增加,细胞深染与皱缩逐渐减轻,细胞形态明显改善,具有剂量依赖性。并在一定时间范围内,随着牡荆苷给药时间的延长,细胞病理形态明显改善,具有时间依赖性。7.牡荆苷对大鼠缺血侧脑组织海马超微结构的影响透射电镜下观察发现假手术组神经元细胞核完整,核膜清晰,可见核孔,胞浆内可见丰富的细胞器,海马线粒体结构清晰,内质网结构完整,有较多的高尔基体与核糖体,1d和3d的超微结构相同。脑缺血再灌注损伤模型组大鼠神经元超微结构显著改变,脑缺血再灌注1d后神经元细胞核中染色质凝聚,胞质肿胀,细胞器减少,部分线粒体峭损伤断裂,线粒体基质电子密度降低,部分线粒体肿胀,扩张呈空泡状。游离核糖体减少,粗面内质网扩张、脱颗粒;脑缺血再灌注损伤模型组3d可见大鼠神经元细胞核固缩,核膜溶解,细胞质基质高度水肿,细胞器明显减少,线粒体结构模糊,嵴数量减少或消失,部分线粒体外膜破裂,粗面内质网扩张呈囊泡状,且3d的比1d的损伤严重。在给药之后,依达拉奉给药组可以明显改善脑缺血再灌注损伤神经元的超微结构,且给药3d比1d的作用好,结果显示细胞核结构较完整,细胞核质肿胀减轻,可见线粒体结构完整,胞浆空泡减少;随着牡荆苷给药浓度的增加,大鼠神经元超微结构明显改善,具有剂量依赖性。并在一定时间范围内,随着牡荆苷给药时间的延长,神经元细胞核水肿减轻,双层核膜结构清晰,核周隙均匀,细胞器逐渐增加,线粒体嵴损伤减轻,粗面内质网水肿程度逐渐减弱,具有时间依赖性。结论:牡荆苷对MACO大鼠脑损伤具有保护作用,其保护机制主要是通过抗氧化应激,抗炎症反应,兴奋性氨基酸毒性三条途径实现的;牡荆苷中,低剂量组对MACO大鼠保护能力较弱,牡荆苷高剂量组保护能力与依达拉奉作用相当,且缺血再灌注大鼠治疗3d效果优于1d。
【关键词】：牡荆苷 MCAO 抗氧化 抗炎(TLR-4 NF-κB TNF-α) EAA
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要5-12
• 英文摘要12-19
• 英文缩写19-21
• 前言21-23
• 材料与方法23-32
• 结果32-38
• 附图38-57
• 讨论57-63
• 结论63-64
• 参考文献64-71
• 综述 金莲花药理活性及临床应用研究进展71-80
• 参考文献77-80
• 致谢80-81
• 个人简历81

【参考文献】

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本文编号：512433