塑化剂DEHP对雄性动物的生殖毒性研究

发布时间：2017-08-31 06:11

  本文关键词：塑化剂DEHP对雄性动物的生殖毒性研究

  更多相关文章： DEHP 雄性生殖毒性 类固醇激素快速调节蛋白 精子 超微结构

【摘要】：在2011年4月,台湾发生了震惊海内外的起云剂事件:卫生部门在对食品进行抽样检查时,发现“净元益生菌”粉末的检测结果出现异样,经过调查确认,此异样为塑化剂DEHP,其浓度高达600ppm(百万分之一),是来自台湾最大的起云剂供应商-昱伸香料公司所供应的起云剂内。到6月13日,受塑化剂污染的问题企业增加到294家,相关受到影响的产品增加到973种。这起事件在台湾岛内食品界、中国大陆食品界,甚至整个亚洲食品界引起巨大轰动的同时,也将塑化剂这一物质全面地带入人们的视线。塑化剂在工业生产上使用范围较广,其中使用最多应用最广泛的是邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP),到2012年,DEHP在我国的生产量约为400万吨,经检测发现,我国每升地下水中DEHP含量约为100μg,而每千克的沉积物中DEHP含量约为200mg。近年来的文献报道,DEHP有多种毒性作用,其中最主要的就是其生殖毒性。为了探讨DEHP的雄性生殖毒性及其作用机制,我们针对DEHP进行了动物实验,我们设置了对照组(玉米油组)、100mg/kg DEHP低剂量组、500mg/kg DEHP中剂量组和1500mg/kg DEHP高剂量组,采用这4个含不同浓度DEHP的剂量组对40只青春期SD雄性大鼠进行灌胃染毒,根据其体重调节给药量,每天染毒1次,每周5天,共染毒6周。染毒期间观察大鼠的生命活动是否正常,待染毒结束后,用乙醚将大鼠麻醉,称量其体质量,然后迅速摘取其双侧睾丸并记录睾丸湿重,之后取一部分睾丸进行病理与电镜检查,以观察DEHP对大鼠睾丸病理结构及超微结构的影响。另外提取睾丸组织RNA,通过进行实时荧光定量PCR实验,测定2个凋亡基因“Caspase-3、Caspase-8”,6个与激素合成有关的基因“类固醇激素快速调节蛋白(St AR)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)、促性腺激素释放激素(Gn RH)及雌激素受体(ERα、ERβ)”共8个基因表达水平的变化,同时提取睾丸组织总蛋白,采用Western Blot法测定3个相关蛋白“促性腺激素释放激素受体(Gn RHR)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)及卵泡刺激素受体(FSHR)”的蛋白表达水平变化。动物实验研究发现:DEHP染毒期间,各组大鼠饮食及生命体征均正常。染毒结束后,各组大鼠间体重及体重增长量均无统计学差异(p0.05),但是在DEHP高剂量组内,大鼠睾丸湿重及睾丸脏器系数比较对照组均显著降低(p0.01),说明DEHP可以通过影响睾丸正常的生长来影响雄性大鼠的生殖功能。睾丸经HE染色后,普通光学显微镜下观察睾丸病理学的变化,结果显示,DEHP低剂量组支持细胞有轻微程度的脱落。DEHP中剂量组内各级生精细胞减少且排列异常,支持细胞有轻微脱落。DEHP高剂量组可见睾丸生精小管严重萎缩,各级生精细胞大量丧失,支持细胞成空泡状,间质细胞发生异常增生现象,这些说明DEHP可以通过影响睾丸内支持细胞、间质细胞与各级生精细胞而产生雄性生殖毒性功能。电镜检查发现,DEHP低剂量组显示生精细胞的细胞核出现核内包含物,胞质内空泡增多,线粒体轻度肿胀,可见线粒体内出现断嵴、脱颗粒现象,精子细胞头部有内含物,精子细胞的线粒体鞘异常。DEHP中剂量组显示精原细胞核内出现大量空泡,细胞膜不完整,胞质内的线粒体数量少,胞质内有大量的空化现象;次级精母细胞及精子细胞的发育异常,精子头部的电子密度降低,精子尾部颈段及中段(线粒体鞘)超微结构异常,线粒体数量减少,出现空化及髓样变化,精子尾部未见微管结构。DEHP高剂量组显示细胞结构紊乱,未见精细胞,可见细胞核体积较大,核凹陷严重且成畸形,核浆比值增大,核膜不光滑且有切迹,核异染色质附着在核膜下,线粒体数量增多且形态多样,线粒体嵴减少,细胞器少,细胞有变性坏死的病理改变,睾丸间质细胞的细胞核严重变形,核仁固缩,细胞内出现包含物,细胞核内的异染色质增多。这部分结果表明DEHP可以影响睾丸内支持细胞、间质细胞与各级生精细胞的超微结构,从而产生雄性生殖毒性。通过对基因表达水平的检测分析发现,癌基因Caspase-3与Caspase-8基因的表达水平在DEHP高剂量组升高(p0.01),在与激素合成有关的基因中,St AR、3β-HSD基因表达水平在DEHP各剂量组均高于对照组,差异均有统计学意义(p0.01或p0.05);17β-HSD基因表达水平只在DEHP高剂量组升高(p0.01),而低剂量组和中剂量组无明显改变(p0.05);ERα基因表达水平在DEHP高剂量组升高(p0.01);ERβ基因表达水平在DEHP低剂量组和中剂量组下降(p0.01),但在DEHP高剂量组升高(p0.01);Gn RH基因表达水平在DEHP中剂量组和高剂量组均显著下降(p0.01或p0.05)。这些从分子水平说明,DEHP产生雄性生殖毒性作用与影响睾丸相关激素基因表达水平改变存在密切关系。在Western Blot实验中发现,与对照组相比,在DEHP高剂量组内,Gn RHR与FSHR蛋白表达水平均显著下降(p0.01或p0.05),3β-HSD蛋白表达水平显著升高(p0.05)。这部分结果与基因表达结果一致,同样从分子水平上说明DEHP可以影响睾丸内激素正常的合成并产生雄性生殖毒性。因此,本文通过动物实验,重点研究DEHP的雄性生殖毒性,发现DEHP可以通过影响睾丸支持细胞与睾丸间质细胞的形态结构与生理功能来影响精子的发生与成熟,进而引起雄性生殖毒性,对于揭示DEHP的雄性生殖毒性作用机制提供了科学依据,对今后深入研究塑化剂对人群的健康危害具有重要的理论意义和实际应用价值。
【关键词】：DEHP 雄性生殖毒性 类固醇激素快速调节蛋白 精子 超微结构
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一章 前言12-24
• 1.1 塑化剂的研究进展12-18
• 1.1.1 DEHP的理化性质12-13
• 1.1.2 DEHP的吸收与代谢13-14
• 1.1.3 DEHP在人群中的污染情况14-15
• 1.1.4 DEHP的毒性15-18
• 1.2 雄性动物的睾丸组织18-21
• 1.2.1 睾丸的结构18-19
• 1.2.2 睾丸正常功能的发挥19-21
• 1.3 雌激素受体ERα 与ERβ21-22
• 1.4 凋亡基因Caspase-3 和Caspase-822-24
• 第二章 材料与方法24-44
• 2.1 实验样本的获得24-25
• 2.1.1 实验试剂与材料24
• 2.1.2 动物模型的建立24-25
• 2.2 光镜观察睾丸病理结构改变25-29
• 2.2.1 实验材料25-26
• 2.2.2 主要试剂的配制26
• 2.2.3 技术路线26-29
• 2.3 电镜下睾丸超微结构的检测29-33
• 2.3.1 材料与方法29-30
• 2.3.2 主要试剂的配置30-31
• 2.3.3 透射电镜观察睾丸超微结构的技术路线31-33
• 2.4 实时荧光定量PCR检测相关基因表达水平的改变33-38
• 2.4.1 材料与方法33-34
• 2.4.2 实时荧光定量PCR（Real- Time PCR）检测相关基因改变的技术路线34-38
• 2.5 Western Blot检测激素相关蛋白表达水平的改变38-44
• 2.5.1 材料与方法38-39
• 2.5.2 主要试剂的配制39-40
• 2.5.3 Western Blot检测激素相关蛋白表达水平改变的技术路线40-44
• 第三章 结果44-56
• 3.1 动物的一般体征44
• 3.2 睾丸的摘取及脏器系数44-45
• 3.3 睾丸病理结构的改变45
• 3.4 睾丸超微结构的改变45-47
• 3.5 实时荧光定量PCR检测相关基因表达水平的改变47-53
• 3.5.1 Real-Time PCR条件探索及引物标准曲线和溶解曲线 3647-51
• 3.5.2 目的基因表达水平的变化51-53
• 3.6 Western Blot检测目的蛋白表达水平的变化53-56
• 第四章 讨论56-60
• 第五章 结论60-62
• 参考文献62-68
• 附录68-70
• 致谢70-72
• 攻读硕士学位期间的研究成果72-73

【参考文献】

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本文编号：763897