预防性应用重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂减轻小鼠胶原性关节炎

发布时间：2017-09-01 08:04

  本文关键词：预防性应用重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂减轻小鼠胶原性关节炎

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【摘要】：背景类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、系统性、严重危害健康的自身免疫性疾病,该疾病的发病率高愈后差,目前仍然没有彻底有效的治疗方法。研究发现,RA的发病机制与病理发展过程与激活的效应T细胞和调节性T细胞密切相关。根据实验室前期利用CIA模型感染日本血吸虫的实验研究发现,Thl和Thl7细胞刺激并维持了关节的炎症反应,而由血吸虫诱导的Th2和Tregs免疫偏移可恢复诱导关节炎中产生的Th免疫应答的失衡,从而探讨了蠕虫在RA治疗中的潜在应用价值。然而利用蠕虫直接感染治疗相关自身免疫性疾病,存在过度感染的风险,难以控制感染程度和效果。SjCy statin是日本血吸虫虫源性分子,已经有体外实验研究证明其具有酶活性和负向免疫调节的作用,主要是抑制木瓜蛋白酶的水解活性和MHC-Ⅱ类抗原递呈的作用,并可以诱导巨噬细胞向M2方向极化。已有研究表明,丝虫的Cystatin同样具有抑制MHC-Ⅱ类抗原递呈的作用和免疫抑制的作用,其可以下调宿主的免疫应答反应,并且在对炎症性肠病(IBD)动物模型的治疗中取得了良好的效果。目的本研究主要利用日本血吸虫虫源性蛋白rSjCytatin在不同时间点应用于胶原性关节炎(CIA)小鼠模型,观察其对小鼠的免疫调节作用或治疗效果。通过评价小鼠的发病率、疾病的严重程度,结合CD4+T细胞亚群的变化,研究并发现新型蠕虫源性免疫调节生物制剂对RA的潜在应用价值。方法构建、表达并纯化出重组的蛋白rSjCytatin,去除咪唑,测定蛋白浓度。构建DBA/1小鼠胶原性关节炎模型(CIA),分别用100μg/次rSjCytatin于造模前4周、造模后4周经腹腔注射小鼠,SPF级环境饲养。所有小鼠从造模后第21天开始记录发病率、临床关节炎评分以评估小鼠关节炎的的病变发生时间和发病的严重程度。造模后第42天在麻醉的情况下无痛处死小鼠,收集标本：血清、足爪组织、膝关节、脾脏等。标本经处理后,H-E染色小鼠膝关节腔切片,微观评分小鼠关节组织病理学变化；ELISA检测小鼠血清内抗CⅡ特异性总IgG及其亚型IgGl、IgG2a,比较预防性应用与延迟性注射rSjCytatin对小鼠自身体液免疫抗体形成的影响；ELISA检测脾淋巴细胞培养上清内细胞因子表达量；流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中CD4+T细胞中个亚群比例：Th1、Th2、Th17和Treg细胞,判断rSjCytatin应用于CIA小鼠对其外周效应T细胞和调节性T细胞比例的影响；qPCR检测CIA小鼠足爪炎症组织内各细胞因子的,mRNA表达水平。结果与CIA阳性对照组小鼠相比,rSjCytatin的预防性应用显著减轻了诱导的小鼠胶原性关节炎的发病率与疾病临床大体评分(AI),改善了病理微观评分,降低了炎症严重程度；血清中的抗CⅡ特异性IgG2a显著下降,而抗CⅡ特异性IgG1水平明显升高；脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-6.表达水平降低,同时伴随着IL-4和IL-10的表达升高；脾淋巴细胞中IFN-γ+CD4+T细胞(Thl)比例显著下降同时IL-4+CD4+T细胞(Th2)比例明显上升；Foxp3+CD25+CD4+T细胞(Treg)上升同时IL-17+CD4+T细胞(Th17)比例明显下降；CIA小鼠足爪组织的RANKL和炎症因子的mRNA的表达水平下降。而对于已经建立关节炎的小鼠,rSjCytatin的延迟治疗并不能改变其关节炎的严重程度与病情,在各项指标检测中,只有Tregs和IL-10的轻微升高。结论重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(rSjcystatin),能够通过预防性干预能有效地降低胶原诱导性关节炎(CIA)的发病率、改善CIA小鼠的临床参数、缓解关节炎的病理严重程度；通过检测检测各项指标可知,预防性应用rSjcystatin在CIA小鼠中起到的的良好效果归于其产生的负向免疫调节作用。
【关键词】：胶原诱导性关节炎 日本血吸虫 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 免疫调节
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 英文缩略词对照表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 1. 前言11-13
• 2. 材料与方法13-24
• 3. 结果24-34
• 4. 讨论34-37
• 5. 结论37-38
• 6. 参考文献38-44
• 附录44-57
• 附录一 个人简历44-45
• 附录二 致谢45-46
• 附录三 综述46-57
• 参考文献51-57

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本文编号：770887