靶向调控大鼠海马CNN3基因表达对癫痫易感性的影响研究

发布时间：2017-09-04 00:06

  本文关键词：靶向调控大鼠海马CNN3基因表达对癫痫易感性的影响研究

  更多相关文章： CNN3 慢病毒 耐药性癫痫 沉默 过表达

【摘要】：[目的]Calponin-3是调节兴奋性突触后膜树突棘的动力蛋白,课题组前期研究提示癫痫患者及动物脑组织和脑脊液中的CNN3基因及其调控蛋白calponin-3均显著升高,但确切机制不清。若能探明神经元calponin-3表达改变与痫性发作间的因果关系,揭示其中相关的环节,可丰富我们对慢性癫痫脑内生化改变的认识、深化对耐药性癫痫的发病机制的认识,为开发新药物开辟新途径。[方法]首先针对大鼠CNN3基因序列设计并鉴定能够靶向干扰和过表达CNN3的慢病毒载体；将包装产生的慢病毒颗粒立体定向注射入大鼠海马即体内转染大鼠海马,通过western blot试验检测干扰和过表达CNN3基因的效果。动态观察8周后,确定干扰和上调calponin-3表达的最佳序列和时间点,分别给对照组、CNN3干扰(CNN3-shRNA)组、CNN3过表达(CNN3-OE)组实验大鼠腹腔注射氯化锂和匹鲁卡品进行癫痫点燃试验。再通过脑电图监测及行为学观察各组癫痫发生的潜伏期、持续时长、严重程度以及癫痫点燃的成功率来评估各组大鼠的癫痫易感性。最后在点燃成功后不同时间点,采用免疫印迹(western blot)实验定量癫痫发作后对照组、CNN3-shRNA组和CNN3-OE组实验鼠脑内calponin-3的变化情况,用膜片钳技术记录癫痫鼠海马区场电位及全细胞电位。[结果]成功构建了CNN3-OE和3个CNN3-shRNA慢病毒干扰载体,转染后8周内对海马CNN3基因水平均有一定调控作用,其中CNN3-shRNA2载体组在转染后的8周内海马CNN3基因编码蛋白calponin-3水平均显著性下调,最高抑制率为73.26%；CNN3-OE慢病毒载体组中海马calponin-3蛋白水平具有统计学意义的升高仅在转染后第14天,上调率为93.88%。选择CNN3-shRNA2载体和CNN3-OE以及它们对应的阴性对照组立体定向转染大鼠海马,在改变calponin-3蛋白表达水平最高的时间点与正常大鼠同时进行癫痫点燃,脑电图监测结果显示各组大鼠均可记录到癫痫样脑电活动,表明癫痫模型构建成功。行为学研究显示：CNN3-OE组癫痫发作的潜伏期为(29.17±19.08)min, CNN3-shRNA2的潜伏期为(40.717±28.40) min, CNN3-shRNA2组癫痫发作的潜伏期显著长于CNN3-OE组,P0.05,差异具有统计学意义。但改变calponin-3蛋白水平后,各组实验鼠诱导癫痫发作所需匹罗卡品剂量、癫痫发作的严重程度均无显著性差异。点燃成功后的大鼠在癫痫发作1小时后麻醉下迅速取脑片,膜片钳记录海马区场电位及全细胞电位均未记录到癫痫样放电。CNN3-shRNA2组大鼠点燃后的48H内calponin-3仍能保持在干预后的较低水平,仅在点燃后1w时升高,远期未出现calponin-3的明显升高；CNN3-0E组大鼠点燃后48H内calponin-3仍处于干预后较高的水平,在48H时出现明显的升高,且升高趋势持续到8W。[结论]本研究成功构建了上调和沉默CNN3基因表达的慢病毒载体,筛选出最佳的shRNA序列为shRNA2-1: 5'-gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCTTTTTTg-3', shRNA2-2: 5'-aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAACTTTATAAGTTCTCTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCg-----3',并经定位注射实现在体调控局部脑区CNN3基因表达,使大鼠海马calponin-3蛋白表达水平显著下降/上调50%以上,且这种高效的干扰效应一直持续到第8周,表明该技术可用于动物模型的基因功能研究,这将对阐明CNN3基因功能、深入了解突触重塑和癫痫发病机制及开辟新的治疗途径等具有重要意义。通过进一步的干预实验,我们发现适当的降低calponin-3的表达水平后实验鼠点燃诱发癫痫发作的阈值升高,这表明calponin-3的过表达与癫痫的发生有关,抑制calponin-3表达可降低癫痫易感性,可能具有抗癫痫效应,为开发新型抗癫痫药物提供了重要的实验依据。
【关键词】：CNN3 慢病毒 耐药性癫痫 沉默 过表达
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-35
• 结果35-47
• 讨论47-51
• 结论51
• 参考文献51-56
• 综述56-65
• 参考文献61-65
• 攻读学位期间获得的学术成果65-66
• 致谢66-67

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