不同亚型的NA基因在H5亚型禽流感灭活疫苗中的作用探讨

发布时间：2017-09-12 03:21

  本文关键词：不同亚型的NA基因在H5亚型禽流感灭活疫苗中的作用探讨

  更多相关文章： H5亚型禽流感 疫苗 流行毒株 交叉免疫

【摘要】：H5亚型禽流感是一种高致病性禽流感,感染性强,致死率高。我国历史上暴发的H5亚型禽流感大多是H5N1亚型,然而近两年,H5N2、H5N8、H5N6、H5N5等亚型的疫情显著增多。AIV抗原变异快,容易产生新亚型或新的变异株,给禽流感疫情的防控带来了巨大的困难,研制能有效防控H5亚型禽流感的疫苗,是防控H5亚型流感疫情重要途径。为了探讨不同亚型的NA基因在H5亚型禽流感灭活疫苗中的作用,本研究选取了三株攻毒毒株和三株制苗毒株进行研究。本研究中所涉及毒株均是华南农业大学兽医传染病学教研室张灶月硕士通过反向遗传技术重组所得。攻毒毒株SH7,rSH7-674NA和rSH7-LZFNA是以A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1)为骨架,NA基因分别来源于毒株A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1),A/Goose/Guangdong/Y674/2014(H5N6),A/Chicken/Hebei/LZF/2013(H5N2)。制苗毒株SH7dHA,SH7dHA674NA和SH7dHALZFNA是以A/Chicken/Guangdong/V/2008(H9N2)为骨架,HA基因对攻毒毒株HA的碱性裂解位点进行修饰降低其毒力所得,NA基因分别来源于毒株A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1),A/Goose/Guangdong/Y674/2014(H5N6),A/Chicken/Hebei/LZF/2013(H5N2)。分别在SPF鸡和SPF级BALB/c小鼠动物模型上进行交叉免疫保护试验,研究内容如下:在SPF鸡模型上,将100只SPF鸡分为四大组,按0.5mL/只的剂量采用胸部肌肉注射分别免疫疫苗SH7dHA,SH7dHA674NA和SH7dHALZFNA,对照组免疫同等剂量PBS。免疫3周后采血进行HA-HI交叉试验和鸡胚中和试验。然后将各大组分为三小组,通过点眼滴鼻分别感染稀释成105EID50的三株攻毒毒株,0.2mL/只,连续观察14d。感染后于第2d、4d、6d采集拭子检测排毒情况。感染第4d每组随机采集3只鸡的脏器检测病毒感染情况,剩余鸡在感染第14d采血测HI效价。结果显示:a、鸡免疫后HI交叉效价明显上升在8.52log2~10.52log2范围内,感染第14d后HI交叉效价仍处于较高水平在7.85log2~9.92log2范围内。鸡胚中和试验结果显示,三组免疫血清对毒株SH7和rSH7-LZFNA的抗体效价较高在246~544范围内,对毒株rSH7-674NA的抗体效价较低在15~30范围内。b、拭子检测结果显示各组感染后第2d排毒率,第4d和第6d排毒率较低,rsh7-674na/sh7dha674na组第6d排毒率仍较高。对照组肺脏病毒滴度较高,log10eid50/0.2ml值在6.35~7.2范围内,其余脏器均能检测到病毒;免疫攻毒组肺脏病毒滴度较低,log10eid50/0.2ml值在1.75~3.75范围内,其余脏器病毒的检出率低。c、对照组感染3d内全部死亡,第5drsh7-674na/sh7dhalzfna组死亡1只,第7drsh7-674na/sh7dha674na组死亡2只,其余各组未出现死亡。在spf级balb/c小鼠模型上,将144只小鼠分为四大组,采用肌内注射100μl/只+皮下注射100μl/只分别免疫疫苗sh7dha,sh7dha674na和sh7dhalzfna,对照组免疫同等剂量pbs,14d后二免。4周后采血进行ha-hi交叉试验和血清总igg检测。然后将各免疫组分为三小组,将稀释成100ld50的三株攻毒毒株以50μl/只的剂量分别经鼻腔感染小鼠(用干冰轻微麻醉后),对照组滴注pbs,连续观察14d,每日称重。感染后第4d每组分别剖杀3只小鼠,采血测igg含量并取鼻甲骨、肺脏、脑检测病毒滴度,剩余小鼠于第14d采血测igg含量。结果显示:a、小鼠免疫后hi交叉效价显著上升在6.75log2~8.4log2范围内,血清中总igg含量显著上升平均在50294.7ng/ml~71066.9ng/ml范围内。b、对照组分别于第9d和第11d全部死亡,其余各组均未死亡。感染后对照组小鼠体重先升后降,各免疫组感染sh7和rsh7-674na体重呈先降后升的缓慢波动,感染rsh7-lzfna体重呈平缓上升趋势。c、对照组鼻甲骨病毒滴度log10eid50/0.2ml值在1.5~2.33范围内,肺脏病毒滴度log10eid50/0.2ml值在2.88~5.5范围内。在鼻甲骨和肺脏中,rsh7-674na/sh7dhalzfna组的病毒滴度均高于rsh7-674na/sh7dha组,其余各免疫组均未在鼻甲骨和肺中检测到病毒。d、感染后第4digg含量平均在42398ng/ml~128170ng/ml范围内,第14digg含量均在52124ng/ml以上。综上所述,在spf鸡模型上三株自制的h5灭活疫苗均能诱导产生较高水平的hi效价,均能对三株不同na亚型的h5禽流感起到较好的交叉免疫保护作用,不同亚型的na基因对h5亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果差异不显著。在balb/c小鼠模型上,三株自制的h5灭活疫苗均能诱导产生较高水平的hi效价和血清总igg,均能对三株不同na亚型的h5禽流感起到较好的交叉免疫保护作用。对于相同ha基因的h5亚型禽流感,n1亚型的疫苗对n6亚型的aiv的保护力比N2亚型的疫苗对N6亚型的AIV的保护力相对更强。
【关键词】：H5亚型禽流感 疫苗 流行毒株 交叉免疫
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文缩略表9-13
• 1 前言13-18
• 1.1 禽流感概述13
• 1.2 禽流感病毒分子生物学13-15
• 1.2.1 禽流感病毒的结构13-14
• 1.2.2 禽流感基因编码蛋白的结构和功能14-15
• 1.3 禽流感灭活疫苗以及基于NA的疫苗研究15-16
• 1.3.1 禽流感灭活疫苗15-16
• 1.3.2 基于NA蛋白疫苗研究16
• 1.4 H5亚型禽流感最近流行情况16-17
• 1.5 重组流感病毒灭活疫苗17-18
• 1.6 本研究的目的和意义18
• 2 材料与方法18-27
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 相关试剂18-19
• 2.1.2 鸡胚和试验动物19
• 2.1.3 引物19-20
• 2.1.4 主要仪器20
• 2.1.5 生物学软件20
• 2.1.6 攻毒毒株20-21
• 2.1.7 制苗毒株21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 病毒的纯化与增殖21
• 2.2.2 流感病毒的鉴定及遗传演化分析21-23
• 2.2.3 疫苗的制备23
• 2.2.4 病毒对SPF鸡免疫攻毒保护试验23-25
• 2.2.5 病毒对SPF级BALB/c小鼠免疫攻毒保护试验25-27
• 3 结果与分析27-47
• 3.1 流感病毒HA和NA基因的鉴定及遗传演化分析27-31
• 3.1.1 HA基因序列分析27-29
• 3.1.2 NA基因序列分析29-31
• 3.2 病毒对SPF鸡免疫攻毒保护试验31-39
• 3.2.1 病毒对鸡胚半数感染量（EID50）31
• 3.2.2 鸡免疫血清HI双交叉中和效价31-32
• 3.2.3 抗原性差异系数R值分析32
• 3.2.4 鸡免疫血清鸡胚中和效价32-33
• 3.2.5 SPF鸡感染后存活率33-35
• 3.2.6 SPF鸡感染后脏器病毒量35-37
• 3.2.7 SPF鸡感染后咽/肛拭子病毒检测37-39
• 3.2.8 SPF鸡感染 14d血清HI双交叉中和效价39
• 3.3 病毒对SPF BALB/c小鼠免疫攻毒保护试验39-47
• 3.3.1 病毒对SPF BALB/c小鼠LD5039-40
• 3.3.2 BALB/c小鼠免疫血清HI双交叉中和效价40
• 3.3.3 抗原性差异系数R值分析40-41
• 3.3.4 BALB/c小鼠感染前血清总Ig G41
• 3.3.5 BALB/c小鼠感染后体重变化41-43
• 3.3.6 BALB/c小鼠感染后存活率43-44
• 3.3.7 BALB/c小鼠感染后脏器病毒量44-46
• 3.3.8 BALB/c小鼠感染后 4d血清总Ig G46-47
• 3.3.9 BALB/c小鼠感染后 14d血清总Ig G47
• 4 讨论47-50
• 5 全文总结50-51
• 致谢51-53
• 参考文献53-55

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;美研制出抗禽流感新药[J];中国禽业导刊;2000年20期

2 徐兆炜;禽流感1999年近况[J];预防医学情报杂志;2000年02期

3 谢健屏;禽流感病毒[J];中国临床医生;2000年04期

4 ;禽流感的病毒特性[J];中国家禽;2001年05期

5 ;禽流感高免球蛋白效果好[J];中国家禽;2001年08期

6 ;农业部、国家质检总局、外经贸部发出紧急通知 要求严堵禽流感[J];内蒙古畜牧科学;2001年03期

7 ;农业部等紧急通知各地严防禽流感[J];四川畜牧兽医;2001年06期

8 罗开健,沈祥广,苏鸿程,劳秋红;禽泰克对禽流感的防治效果试验[J];养禽与禽病防治;2001年02期

9 卢建红;禽流感的危害[J];湖南农业;2001年03期

10 魏凤祥,周琦,张萍,叶喜永;加强禽流感诊断 提高预防能力[J];中国动物保健;2001年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 孙晓林;;禽流感和公共卫生[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年

2 何义林;叶冬青;;禽流感病毒对人类感染机制的研究进展[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

3 春阳;李东;;再论“以科学发展观应对禽流感事件”——评禽流感病毒变种两次恐慌论[A];首届中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2008年

4 邓洁丽;段明星;俞初一;江龙;;聚联乙炔有序组装体在识别禽流感病毒方面的应用研究[A];中国化学会第十二届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2009年

5 孙恩泽;谢敏;赵海粟;黄碧海;刘书琳;张万坡;张志凌;王汉中;庞代文;;量子点标记禽流感病毒[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年

6 黄志坚;陈强;李清禄;王寿昆;江和基;;不同消毒剂对禽流感病毒的杀灭试验[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式，促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年

7 周祖华;张敏;程礼明;徐彬;沈彩信;;禽流感流行趋势分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

8 王志宇;张议文;刘桂林;;禽流感病毒的分子生物学研究进展[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

9 刘迎芳;饶子和;;禽流感病毒(H5N1)RNA聚合酶PA亚基相关三维晶体结构与功能分析[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年

10 韦婷;胡杰;兰彬;陆文俊;苏凯;覃芳芸;;广西暴发中低毒力禽流感情况报告[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 农业部动物疫病诊断与流行病学中心主任 崔尚金 博士;候鸟发生禽流感给我们的警示[N];中国畜牧兽医报;2005年

2 莫书莹;世卫警告：禽流感或大流行全球经济应警惕[N];第一财经日报;2005年

3 本报记者 魏红欣;禽流感“啄”痛全球经济[N];国际金融报;2005年

4 本报记者　许凯;狙击禽流感：一场鸟与人的战争[N];国际金融报;2005年

5 新华社记者　杨爱国;防控禽流感需要加强国际合作[N];光明日报;2005年

6 李杨;禽流感疫情不会长期影响农产品期价[N];金融时报;2005年

7 罗政、夏文辉;香港强化防止禽流感措施[N];人民日报海外版;2004年

8 本报记者　张向永　赵秀芹;禽流感让全世界手牵手[N];市场报;2005年

9 ;禽流感病毒能否绝迹？[N];中国石油报;2004年

10 何源;严防禽流感从境外传入我国[N];中国食品质量报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年

2 赵蔚;基于磁分离和荧光量子点标记的高灵敏禽流感病毒检测[D];武汉大学;2012年

3 区嘉贤;H7N9禽流感患者的临床特征及预后分析[D];复旦大学;2014年

4 刘三红;禽流感的数学建模及数值模拟[D];华中师范大学;2015年

5 樊兆斌;野鸟源禽流感病毒(AIV)分离株的遗传进化及其致病性研究[D];东北林业大学;2014年

6 桑晓宇;H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠模型中水平传播的分子机制研究[D];中国农业科学院;2015年

7 杨文涛;靶向树突状细胞通用型禽流感病毒重组乳酸菌的研究[D];吉林农业大学;2015年

8 石霖;北方某省主要亚型禽流感现地调查分析及RT-LAMP检测方法研究[D];东北农业大学;2015年

9 张晓剑;HA蛋白糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒复制、致病性和抗原性的影响[D];扬州大学;2014年

10 朱闻斐;H7N9禽流感病毒致病与传播机制研究[D];中国疾病预防控制中心;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 高晓龙;2014年度中国东部候鸟禽流感病毒分离与鉴定[D];中国农业科学院;2015年

2 徐晓龙;H5和H7亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立[D];中国农业科学院;2015年

3 韩苗苗;一类人畜共患的禽流感传染病传播模型[D];大连理工大学;2015年

4 王秋珍;H9N2禽流感病毒NS1蛋白诱导的氧化应激促进DF-1细胞凋亡[D];西北农林科技大学;2015年

5 梁威;5株H9N2亚型AIV血凝素结构分析及感染A549细胞的蛋白质组学研究[D];山东农业大学;2015年

6 刘媛媛;MDCK细胞表达鸡ST3GAL I基因对H9亚型禽流感病毒增殖情况的影响[D];河南农业大学;2013年

7 孟芳;H9N2亚型禽流感HA基因演化及其内部基因在H5N2亚型流感病毒演化中的作用[D];山东农业大学;2015年

8 韩雯;山东地区H9N2禽流感流行病学调查及流行毒株分子生物学检测[D];山东农业大学;2014年

9 查国飞;昆虫细胞表达重组H5亚型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究[D];安徽农业大学;2014年

10 侯群;新疆青格达湖湿地鸟类中H5、H7亚型AIV和NDV流行病学监测[D];石河子大学;2015年

，

本文编号：834780