JIP3调节皮层神经元放射状迁移的研究

发布时间：2017-09-14 23:03

  本文关键词：JIP3调节皮层神经元放射状迁移的研究

  更多相关文章： JIP3 大脑皮层 放射状迁移 胚胎宫内电转

【摘要】：背景大脑皮层是大脑中最大的结构,它由很多神经元构成。大脑皮层是大脑结构中最为复杂的区域,发育完全的大脑皮层可以形成高度有序的六层层状结构。皮层形成的六层独特结构由不同形态及功能的细胞构成,其对于皮层神经环路形成、认知功能、情感以及意识都具有重要的作用。因此,在发育过程中,新生的神经元准确的迁移到其最终的位置对于实现大脑的诸多功能是至关重要的,例如对于形成皮层精确的层状结构以及后续神经环路的形成都是必不可少的。已有研究证实,皮层神经元可以从室管膜区/室管膜下区的神经前体细胞分裂产生,然后沿着放射性胶质细胞进行放射状迁移,通过intermediate zone到达发育中的corticalplate。目前对于皮层神经元放射状迁移的机制研究,已有很多信号通路如reelin信号通路、JNK信号通路等被报道参与到神经元的迁移,但具体参与调控的分子机制仍在继续研究。JIP3是JNK信号通路的一个支架蛋白,它在成年的大脑中有高表达。在老鼠脑内敲除JIP3会导致发育期的端脑连接缺失。JIP3还可以通过调控FAK影响癌细胞的运动能力。然而,作为JNK的支架蛋白,JIP3在皮层的发育过程中是否会参与神经元的迁移还没有研究过。在我们的研究中,我们利用胚胎宫内电转干扰JIP3在即将分化为皮层神经元的神经前体细胞中的表达,从而证实了JIP3在皮层神经元放射状迁移过程中的作用。我们发现,干扰JIP3的表达之后可以破坏神经元的迁移,进一步长时程观察出生后的电转小鼠证实JIP3对皮层神经元放射状迁移的影响是一种延缓的效应。最后,我们通过共转siJIP3和JIP3不同结构域缺失突变体,研究JIP3调控神经元放射状迁移的关键功能域,以此研究调控皮层神经元放射状迁移的机制。我们的结果显示,JIP3介导kinesin转运的KBD和LZ结构域对于神经元迁移具有重要的作用。这些结果证实,在皮层发育过程中中JIP3对神经元放射状迁移发挥着重要的调控作用。目的：1.探讨JIP3与大脑皮层发育的关系,进一步证实JIP3对于皮层神经元放射状迁移的作用。2.研究JIP3调控皮层神经元放射状迁移的机制,为理解皮层发育提供新的理论。方法：1.蛋白印迹实验将不同发育时期的小鼠皮层分离出来,用裂解液匀浆处理后提取蛋白样品。蛋白样在95℃煮5min,然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白,将蛋白转移至PVDF膜上。经过抗体孵育、显色之后分析结果。2.胚胎宫内电转怀孕15.5天的孕鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,5-10min之后,将已麻醉的老鼠腹部向上放置在操作台上。沿着腹部中线在腹部剪开外皮及内皮,开口2cm左右。将中部有椭圆形开口的纱布覆盖在孕鼠腹部。用镊子将胚胎拉出,将子宫左右两侧的胎鼠分别放置在纱布的左右两侧,用预热的生理盐水浸润胚胎,防止其变干。将含有0.1% Fast Green、浓度为1.5ug/ul的质粒用微注射管注射到脑室中,用电极夹持住胎鼠头部进行电转。这个电转过程要在40min之内完成,并将胚胎塞回子宫内,并将手术开口进行缝合。将手术完成的孕鼠放置在能维持体温的环境中直至老鼠恢复意识。3.质粒构建JIP3小干扰RNA的序列插入到U6启动子的下游,其靶向的序列是：CAGGCC GAG GAG AAA TTC A。干扰效率是在HEK-293细胞中分别电转干扰质粒和对照质粒测定的。带有EGFP标签的JIP3-resistant质粒通过点突变的方式构建,突变的位点未改变原来氨基酸的序列。突变之后的序列是：CAaGCg GAa GAG AAg TTC A。用于胚胎宫内电转的质粒是以pCAGIG-IRES-EGFP为载体。4.免疫组织化学取出的大脑在4%的多聚甲醛中固定,过夜后转移至30%的蔗糖溶液中,直至脑沉至溶液底部表明组织以脱水完全。将大脑进行包埋冰冻处理后进行切片。切好的组织切片经过抗体孵育之后进行显微拍照,最终进行图片处理及数据分析。结果：1.JIP3参与大脑皮层的发育1.1 JIP3在发育期和出生后的皮层表达谱JIP3在胚胎期和出生后都有较高的表达,在E13-E17和PO之后两个时间段,JIP3的蛋白水平都有明显的增加。1.2干扰JIP3的表达损害了皮层的六层层状结构利用在端脑中条件性下调JIP3表达的转基因小鼠,发现E19和成年的小鼠的大脑皮层的层状结构都变得紊乱。而且成年小鼠的皮层厚度变薄。2.JIP3调节皮层神经元的放射状迁移2.1干扰JIP3不影响神经前体细胞的增殖通过BrdU染色发现,干扰了JIP3之后处于分裂的细胞数目没有受到影响。2.2干扰JIP3的表达不影响神经元形态的极化状态分析在IZ区神经元的形态发现,干扰JIP3之后对神经元有多极向双极转化的过程没有影响。2.3下调JIP3的表达损害了神经元的迁移使用干扰效率达到90%的小干扰RNA,电转到E15.5的胎鼠脑内。三天之后检测神经元的迁移情况发现,干扰JIP3的表达之后,神经元主要滞留在了IZ。3.JIP3通过延迟神经元的迁移来调节皮层的发育。在E15.5进行胚胎电转之后,在PO和P7取材,跟对照组相比发现,干扰JIP3之后神经元迁移到上层的细胞数目仍不能达到对照组水平,但是神经元仍处在不断迁移的过程中。4.JIP3调节皮层神经元放射状迁移的机制我们共转了JIP3-resistant和siJIP3两种质粒,干扰JIP3引起的皮层神经元放射状迁移的缺陷得到了缓解。接下来,我们又将JIP3的不同结构域的缺失突变体分别与siJIP3共转,发现JIP3介导kinesi n转运货物的KBD和LZ结构域对调控皮层神经元放射状迁移非常重要。结论：1.我们的研究得到JIP3在发育的皮层中的表达谱,在胚胎期缺失JIP3使皮层层状结构发生紊乱。2.下调JIP3之后延迟了神经元的迁移,而不影响神经元形态的极化和神经前体细胞的增殖。3.JIP3结构域KBD和LZ对JIP3神经元迁移至关重要。创新点：1.量化了JIP3在发育期以及出生后不同时间点的表达情况；2.干扰JIP3表达之后延缓了皮层神经元放射状迁移；3.JIP3参与转运的功能域KBD、LZ对调控神经元迁移至关重要。
【关键词】：JIP3 大脑皮层 放射状迁移 胚胎宫内电转
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q427
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符号说明15-17
• 前言17-20
• 材料与方法20-38
• 实验结果38-45
• 讨论45-48
• 附图48-52
• 参考文献52-55
• 致谢55-57
• Publications57-58
• 学位论文评阅及答辩况58

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本文编号：852826