基于FXR的蒲公英乙酸乙酯提取物利胆作用研究

发布时间：2017-09-16 06:12

  本文关键词：基于FXR的蒲公英乙酸乙酯提取物利胆作用研究

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【摘要】：背景：胆汁淤积(Cholestasis),又称为胆汁淤积综合征,指在肝细胞或胆管水平胆汁生成、分泌或流动障碍,导致胆汁不能正常进入十二指肠的一组疾病共同的临床症状,而引起黄疽、皮肤瘙痒等症状的综合征。胆汁淤积主要包括肝外胆汁淤积和肝内胆汁淤积两大类,是许多肝胆疾病共有的基础病变,其病因包括病毒感染、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、药物性肝损、妊娠期肝内胆汁淤积等多种因素,因此胆汁淤积症是内科临床上的常见综合症,发病率极高(如妊娠期肝内胆汁淤积发病率高达13%),严重威胁人类健康。蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)具有清热解毒,消肿散结,利尿通淋功效,临床上对慢性胆囊痉挛及结石症有效。经本实验前期研究发现,蒲公英能促进正常大鼠胆汁分泌,保护肝细胞的药理活性,有望开发成为一种临床上治疗胆汁淤积的新药。但其作用机制未见相关报道,有待进一步研究。因此,利用现代化分析手段和分子生物学技术对利胆的中草药如蒲公英作用于机体的信号通路进行探索,进一步研究蒲公英保肝利胆的分子机制,不仅为开发安全有效的抗胆汁淤积药物提供新的研究思路,还可指导临床科学用药,具有重要的研究意义和经济价值。研究目的：研究蒲公英乙酸乙酯提取物(The Ethyl Acetate Extract Of Taraxacum, TEE)与咖啡酸(Caffeic acid)通过法尼醇受体(Farnesoid X receptor, FXR)及其靶基因胆固醇7a羟化酶(Cholesterol 7a-hydroxylase, CYP7A1)胆盐输出泵(Bilesalt export pump, Bsep)对α-萘异硫氰酸酯(a-naphthylisothiocyanate, ANIT)诱导的急性肝内胆汁淤积模型大鼠护肝利胆的作用及机制。方法：1.观察胆汁淤积模型大鼠灌服蒲公英正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取物后,对胆汁排泄、肝功能等生化指标表达的影响。模型组灌胃给予α-萘异硫氰酸酯ANIT (100 mg/kg)造成急性肝内胆汁郁积模型。蒲公英正丁醇提取物组灌胃给予蒲公英正丁醇提取物及灌服ANIT(100mg/kg)造模。蒲公英乙酸乙酯提取物组灌胃给予蒲公英乙酸乙酯提取物及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。蒲公英石油醚提取物组灌胃给予蒲公英石油醚提取物及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。阳性对照组灌胃给予熊去氧胆酸(50mg/Kg)及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。模型对照组灌胃给予0.5% CMC-Na溶液和植物油(用于溶解ANIT的溶剂)作为模型对照。各组大鼠末次药后2h,腹腔注射20%乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,进行胆管插管手术,收集胆汁、全身血液和肝脏。测定胆汁流,称量肝重,检测肝功能相关生化指标(丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血浆中总胆红素(TB)和总胆汁酸(TBA))的含量。2.蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)的急性毒性考察。将100只昆明(KM)小鼠按体质量随机分为10组,每组10只,雌雄各半。按最大剂量开始给药,之后以0.75倍递减,给药4h后正常饲养,观察7 d。3.蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)指征成分咖啡酸在正常大鼠和ANIT诱导的急性肝内胆汁淤积模型大鼠中的药动学比较建立简便、快速、灵敏的生物样品中咖啡酸的HPLC检测方法,并且对专属性、灵敏度、线性范围、回收率、精密度、基质效应和稳定性等方法学进行确认。正常大鼠和ANIT诱导的急性肝内胆汁淤积模型大鼠灌服TEE,测定各时间点的血药浓度,计算药动学参数,比较TEE在正常大鼠和ANIT诱导后48h的急性肝内胆汁淤积模型大鼠血浆内血药浓度的差异。4.观察胆汁淤积模型大鼠分别灌服TEE及咖啡酸高中低三个剂量后,对胆汁排泄、肝功能等生化指标、胆汁池、病理切片分析、肝脏中FXR、CYP7A1和Bsep的基因表达及其蛋白表达的差异性。模型组灌胃给予(100 mg/kg)造成急性肝内胆汁郁积模型。TEE(高中低)组灌胃给予相应剂量的TEE及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。咖啡酸组灌胃给予相应剂量的咖啡酸及灌服ANIT (100 mg/kg)造模。阳性对照组灌胃给予熊去氧胆酸(50mg/Kg)及灌服ANIT (100 mg/k g)造模。模型对照组灌胃给予0.3%CMC-Na溶液和植物油作为模型对照。各组大鼠末次药后2h,腹腔注射20%乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,进行胆管插管手术,收集胆汁、全身血液和肝脏。测定胆汁流,称量肝重,检测肝功能相关生化指标(ALT、AST、ALP、TB和TBA的含量和对肝脏组织进行病理切片分析。采用LC-MS/MS检测胆汁池中的17种胆酸成分并采用实时荧光定量RT-PCR检测肝脏中FXR、CYP7A1和Bsep的基因表达水平及Western Blot测定其蛋白表达量的变化。结果：1.在ANIT灌胃造成大鼠急性肝内胆汁淤积实验中,与模型对照组比较,模型组胆汁排泄量和胆汁中TB, TBA的含量均降低(P0.05),肝比重增大(P0.05),血浆中ALT、AST、ALP、TB、DB、TBA的含量升高(P0.05)。肝脏匀浆液中TBA和TB含量升高(P0.05)。分别给药后发现,正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物组,与模型组比较,乙酸乙酯提取物组能显著增加胆汁排泄量(P0.05),降低血浆中ALT、AST、ALP、TB、DB、TBA和肝脏中TB、DB、TBA的含量(P0.05),以及显著提高胆汁中TB的含量(P0.05)。2.蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)半数致死量LD50=306.25mg/kg,95%的可信限=249.75-376.99mg/kg。小鼠死亡原因可能为肝脏局部缺血性坏死。3.咖啡酸的血药浓度在0.1～10μg/mL范围内线性关系良好(r2=0.9994),日内及日间精密度和准确度等方法学均符合要求,血浆中无内源性基质干扰,稳定性良好。与正常大鼠相比,TEE在急性胆汁淤积模型大鼠组的AUC(33.15±2.97vs 9.61±0.76)更大,但清除率(1.97±0.26 vs 5.73±0.37)较小。4.在ANIT灌胃造成大鼠急性肝内胆汁淤积实验中,与模型组比较,TEE高中剂量组胆汁排泄量、胆汁池和胆汁中TBA的含量均升高(P0.05),血浆中ALT、AST、ALP、TB、TBA的含量降低(P0.05),肝脏匀浆液中TBA含量降低(P0.05),病理切片下观察肝脏损害情况显著减轻。在基因表达和蛋白表达水平上,TEE能增加肝脏中FXR、CYP7A1、Bsep基因和蛋白的表达(P0.05)。而蒲公英有效成分咖啡酸能使胆汁排泄量、胆汁池和胆汁中TB、TBA的含量均升高(P0.05),血浆中AST、ALP、TB、TBA的含量降低(P0.05),肝脏匀浆液中TB含量降低(P0.05)；病理切片下观察肝脏损害情况无明显改善；在基因表达和蛋白表达水平上,咖啡酸能增加肝脏中FXR、Bsep基因和蛋白的表达(P0.05),对CYP7A1的作用比TEE低。结论：蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)及其活性成分咖啡酸能不同程度地缓解ANIT导致的胆汁异常蓄积和返流入血的病变,从而减少黄疸,改善肝功能；TEE能刺激FXR表达的上调,表达增强的FXR反馈性抑制胆汁酸合成酶CYP7A1的表达,减少胆汁酸的合成,激活肝细胞膜上Bsep的转录,加速胆汁酸从肝细胞向胆小管的外排转运；这可能是TEE通过FXR调控胆汁酸的合成和代谢利胆护肝的作用机制之一,表现了其保肝利胆、抗胆汁郁积的作用。
【关键词】：胆汁淤积 蒲公英 咖啡酸 FXR
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 引言14-16
• 第一章 文献研究16-27
• 第一节 胆汁淤积相关性研究进展16-24
• 第二节 中医药与胆汁淤积24-25
• 第三节 蒲公英近年的研究进展25-27
• 第二章 实验研究27-70
• 第一节 蒲公英水煎液的利胆作用研究27-32
• 一、实验目的27
• 二、实验材料27
• 三、实验方法27-29
• 四、指标检测29
• 五、结果与分析29-32
• 第二节 蒲公英有效部位的筛选实验32-40
• 一、实验目的32
• 二、实验材料32
• 三、实验方法32-34
• 四、指标检测34
• 五、结果与分析34-40
• 第三节 蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)化学成分分析与制备条件优化40-43
• 一、实验目的40
• 二、实验材料40
• 三、实验方法40
• 四、结果与分析40-43
• 第四节 蒲公英乙酸乙酯提取物(TEE)的急性毒性考察43-46
• 一、实验目的43
• 二、实验材料43
• 三、实验方法43-44
• 四、结果与分析44-46
• 第五节 TEE中咖啡酸在正常大鼠与胆汁淤积模型大鼠体内的药动学研究46-49
• 一、实验目的46
• 二、实验材料46
• 三、实验方法46-47
• 四、结果与分析47-49
• 第六节 TEE,咖啡酸对胆汁淤积模型大鼠利胆作用的对比49-70
• 一、实验目的49
• 二、实验材料49-50
• 三、实验方法50-52
• 四、指标检测52-69
• 五、小结69-70
• 结语70-72
• 参考文献72-78
• 附录78-79
• 在校期间发表论文情况79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：861332