血肿瘤屏障体外模型的建立及天然冰片对其调控的效果和机制研究

发布时间：2017-09-26 16:19

  本文关键词：血肿瘤屏障体外模型的建立及天然冰片对其调控的效果和机制研究

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【摘要】：目的：通过建立体外血肿瘤屏障模型(blood-tumor barrier,BTB),研究天然冰片开放血肿瘤屏障模型的时效、量效关系及对紧密连接蛋白的调控作用；进一步结合在体动物模型上,研究天然冰片提高抗肿瘤药物透过血肿瘤屏障的药效学研究,阐明天然冰片调节血肿瘤屏障开放的效果和机制,为临床上神经胶质瘤等颅内疾病的治疗开辟-条新的途径。方法：1.体外BTB细胞模型的建立大鼠C6胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)非接触共培养建立体外BTB细胞模型,采用内皮细胞跨膜阻抗(TEER)及HRP流量对模型性能进行评价。2.天然冰片药材中右旋龙脑的含量测定采用气相色谱法测定天然冰片药材中右旋龙脑的含量。GC条件为：色谱柱：ZB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);柱温：梯度升温,90℃保留2min,以10℃/min上升至110℃,保留2min,以30/℃/min上升至160℃,保留2min；进样口：210℃；FID检测器温度：250℃；高纯氮气压力：5psi；分流比：10：1；空气流速：450mL/min;氢气流速：45mL/min;进样量：1μL。3.天然冰片对体外血肿瘤屏障模型通透性及紧密连接相关蛋白表达的影响实验分4组：空白对照组、冰片低剂量组(25μg/mL)、冰片中剂量组(50μg/mL)、冰片高剂量组(100μg/mL),每组3个复孔。HRP流量测定不同剂量天然冰片对体外BTB细胞模型通透性的影响；免疫荧光及ELISA方法测定Claudin-5、Occludin、ZO-1、 F-actin的蛋白表达及分布变化。4.大鼠C6脑胶质瘤在体模型的制备SD大鼠禁食不禁水12h,10%水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉,脑右侧尾状核状处注射C6胶质瘤细胞2.5×106(25μL),无菌骨蜡封闭骨孔,缝合皮肤,切口消毒,常规饲养。5.天然冰片对甲氨蝶呤在C6脑胶质瘤模型大鼠体内药动学及脑组织分布的影响制备成功的C6脑胶质瘤模型大鼠随机分为溶媒对照组(0.5%羧甲基纤维素钠)、冰片低剂量组(35mg/kg)、冰片高剂量组(140mg/kg),每组28只。灌胃给药(10mL/kg),1h后,3组大鼠均尾静脉注射甲氨蝶呤(20mg/kg)。于甲氨蝶呤注射后的不同时间点取血及脑肿瘤组织,每个时间点血浆和脑组织的样本均为4只大鼠。色谱条件：色谱柱Synergi Hydro-RP C18(250mm×4.6mm,4μm);流动相：甲醇-0.3%冰醋酸/0.25%三乙胺溶液(26：74)；流速：1mL/min;自动进样器温度：4℃；柱温：35℃；检测波长：302nm。结果：1.成功建立了体外BTB细胞模型,较好地反映了体内的情况,可用于模拟体内环境,用于药物跨血肿瘤屏障特性方面的研究。2.本实验所使用的天然冰片中右旋龙脑含量达到97.027%,符合中国药典2010年版一部规定,可用于后续实验研究。3.HRP流量测定天然冰片对体外BTB细胞模型通透性的影响,结果显示：与空白对照组相比,天然冰片低剂量组(25μ/mL)、中剂量组(50μg/mL)、高剂量组(100μg/mL)的HRP通透率均随着作用时间的延长逐渐提高,其中与空白组各相应时间点相比天然冰片低剂量组在10、30、60、120、240min时,通透率明显提高,具有统计学意义(P0.01)；中、高剂量组全部时间点的通透率明显高于空白组各相应时间点的通透率,具有统计学意义；从不同组同一时间点的通透率可以看出,呈现剂量依赖趋势,高剂量组(各时间点通遗率)中剂量组(各时间点通透率)低剂量组(各时间点通透率)。从相邻时间点的透过率差值分析,低、中、高剂量组均在10-30min、30-60min时,HRP透过率提升最明显,60-120min时通透率增加幅度降低,120-240min时,通透率恢复正常水平。4. ELISA方法及免疫荧光法测定体外血肿瘤屏障上紧密连接相关蛋白Claudin-5、 Occludin、ZO-1、F-actin的表达变化。ELISA测定结果显示：Claudin-5蛋白的表达量随作用时间的延长先降低,然后又逐渐升高恢复至药前水平,在30min时表达量最低,并且在30、60min时间点存在剂量依赖性,高剂量(clandin-5)〈中剂量(Claudin-5)低剂量(Claudin-5)药前(Claudin-5)oOccludin蛋白不同时间点间及不同组别间没有显著性的变化,表明天然冰片在25μg/mL-100μg/mL剂量范围内,作用于BTB细胞模型4h,对Occludin蛋白的表达没有显著性的影响(P0.05)。天然冰片低剂量给药后,Z0-1蛋白各时间点的表达量与给药前相比差异无统计学意义(P0.05)；中、高剂量组ZO-1蛋白表达量先降低后又逐渐升高,且分别在60、30min时表达量最低(P0.01)。F-actin蛋白,各组表达量均先降低后逐渐升高,在30、60min时各组蛋白量显著低于药前表达量,差异具有统计学意义,并在30、60min时各组F-actin蛋白量存在剂量依赖趋势高剂量(F-actin)中剂量(F-actin)低剂量(F-actin)药前(F-actin)°免疫荧光法测定的四个蛋白的表达变化与ELISA实验结果基本一致。5.成功制备大鼠C6脑胶质瘤模型,并建立了测定血浆及脑组织匀浆液中甲氨蝶呤含量的HPLC法。与溶媒对照组比较,冰片高、低剂量组血浆中甲氨蝶呤AUC0-t,AUCO_。均显著降低(P0.01)；冰片高剂量组脑肿瘤组织中甲氨蝶呤AUC0_t,AUCO-∞显著升高(P0.05),冰片低剂量组脑肿瘤组织中甲氨蝶呤AUC0_t, AUC0-∞亦有升高趋势,但与溶媒对照组比较无显著差异(P0.05)。结论天然冰片通过调控相关紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的表达和分布的改变,从而调节体外BTB细胞模型的通透性；在体实验进一步验证了天然冰片能够调节血肿瘤屏障的通透性,提高提高抗肿瘤药物甲氨蝶呤的脑组织生物利用度。
【关键词】：天然冰片 体外BTB细胞模型 紧密连接相关蛋白 甲氨蝶呤
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第1章 文献研究14-20
• 第1节 血肿瘤屏障14-16
• 第2节 构建体外BTB模型的方法16-19
• 1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)+C6胶质瘤细胞16-17
• 2 鼠脑微血管内皮细胞(rBMECs)+C6胶质瘤细胞17-18
• 3 人脑微血管内皮细胞(hBMEC)+脑周细胞(PC)+U251胶质瘤细胞(U251)18-19
• 第3节 BTB模型评价方法19-20
• 1 电镜观察紧密连接19
• 2 液面渗漏试验19
• 3 跨内皮电阻19
• 4 通透性试验19-20
• 第2章 实验研究与结果分析20-63
• 第1节 体外BTB细胞模型的建立20-26
• 1 体外BTB细胞模型的建立20-26
• 第2节 天然冰片对体外BTB模型通透性及紧密连接蛋白的影响26-50
• 1 天然冰片药材中右旋龙脑的含量测定26-30
• 2 天然冰片给药剂量选择30-33
• 3 HRP流量测定天然冰片对体外BTB模型通透性的影响33-36
• 4 ELISA方法测定天然冰片对体外BTB细胞模型紧密连接相关蛋白表达的影响36-42
• 5 免疫荧光法检测天然冰片对体外BTB模型紧密连接蛋白表达和分布的影响42-50
• 第3节 天然冰片促进抗肿瘤药物甲氨蝶呤透过血肿瘤屏障的药效学研究50-63
• 1 大鼠C6脑胶质瘤动物模型的建立50-54
• 2 建立生物样品中甲氨蝶呤含量测定的HPLC法54-59
• 3 天然冰片对甲氨蝶呤在大鼠C6脑胶质瘤模型体内药动学的研究59-63
• 结语63-64
• 参考文献64-68
• 附录68-70
• 附录Ⅰ 缩略语中英文说明68-69
• 附录Ⅱ 在研期间发表的论文69-70
• 致谢70

【参考文献】

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本文编号：924521