SHP2抑制剂PHPS1对动脉粥样硬化的保护作用及机制研究

发布时间：2017-09-27 21:03

  本文关键词：SHP2抑制剂PHPS1对动脉粥样硬化的保护作用及机制研究

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【摘要】：心血管疾病由于发病人数多并且逐渐年轻化,危险因素广泛,病程时间长,并发症多,缩短人类的寿命和降低人民生活质量。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是导致心血管疾病的主要病理学基础。在AS形成发展过程中,血管内皮细胞损伤、泡沫细胞沉积、血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖和血管局部的炎症反应等是AS疾病发生发展的关键病理环节。蛋白酪氨酸磷酸酶N11(protein tyrosine phosphatase N 11,SHP2)是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)的其中一种,表达于机体的各种组织和细胞,能够催化酪氨酸去磷酸化。SHP2参与多条重要信号通路,处于多条信号通路的交汇处,具有传导信号和起到中间媒介的作用,能够直接或间接地指导细胞生长分化等生命活动。PHPS1(phenylhydrazonopyrazolone sulfonate1)是一种具有细胞渗透性的SHP2抑制剂,能够有效抑制SHP2磷酸化并阻断其参与的细胞活动和疾病进程。PHPS1对AS的影响及其相关机制目前尚未有研究。PHPS1在高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型中有何作用,它能否降低AS的发病率和减慢病程的进展?其作用机制是通过影响脂质代谢,或是抑制炎症反应,再或者是减少VSMC的增殖?SHP2在AS的发生发展中发挥什么作用?这些都是本实验所要解决的研究内容。研究目的:1.通过建立高脂诱导的动脉粥样硬化小鼠模型,探讨PHPS1对动脉粥样硬化发生发展的作用,以及对动脉粥样硬化的炎症反应和血管平滑肌细胞增殖的影响。2.探讨SHP2在ox LDL刺激血管平滑肌细胞增殖中的作用,并检测SHP2抑制剂PHPS1是否可抑制SHP2所诱导的细胞增殖。3.初步探讨PHPS1抑制SHP2介导的血管平滑肌细胞增殖的信号转导途径。通过研究SHP2和PHPS1在AS的发生发展中的作用及阐述这种作用的具体机制,为AS的发病机制提供一种新的理论,将SHP2作为治疗靶点,为临床上AS患者的治疗提供新思路。研究方法:体内实验:30只Ldlr-/-小鼠适应性喂养一周后,按体重大小随机分为三组:动脉粥样硬化组(AS组)、动脉粥样硬化+抑制剂组(AS+PHPS1组)、动脉粥样硬化+溶剂组(AS+Vehicle组)。高脂饮食(含1.25%胆固醇)喂养,持续4周。1.生命体征、体重、血糖:每天观察小鼠毛发、饮食排便及活动度,每周监测小鼠体重,检测随机血糖。2.血脂:4周后取血,离取上清。测定TG、TC、HDL-C、LDL-C的水平。3.斑块面积评价:戊巴比妥钠麻醉小鼠,显微镜下观察主动脉根部斑块形成情况。分离出心脏和主动脉。部分主动脉进行大体油红O染色。部分主动脉检测细胞因子、蛋白表达水平。石蜡切片观察主动脉起始处斑块病理形态学,分别采用Movat染色、免疫组化、天狼星红染色分析AS中斑块、平滑肌细胞、胶原的比例。4.RT-PCR:抽提小鼠心脏总RNA,检测主动脉血管中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β等细胞因子的m RNA水平。5.Western blot:小鼠心脏匀浆后,抽提总蛋白,检测SHP2主要信号通路中各蛋白磷酸化水平的改变。体外实验:1.分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞,ox LDL刺激刺激后Western blot检测SHP2蛋白表达水平。2.Brd U实验检测SHP2介导血管平滑肌细胞的增殖以及PHPS1的抑制作用。3.采用Western blot技术,检测SHP2与ERK信号转导通路的相关性,以及PHPS1抑制SHP2后对ERK通路激活的影响。研究结果:体内实验:显微镜下三组小鼠均可见内膜明显增厚,管腔狭窄,粥样斑块形成。斑块表层有大小不等纤维帽,部分可见破裂。纤维帽内可见脂质沉积,大量泡沫细胞及坏死组织,说明成功建立Ldlr-/-小鼠动脉粥样硬化模型。1.各组小鼠生长正常,毛发浓密,色泽黝黑,无出现脱毛、皮肤炎症,饮食及分泌物正常。体重、血糖、血脂水平差异无统计学意义。2.AS+PHPS1组较AS组和AS+Vehicle组斑块面积减小。3.RT-PCR结果显示,PHPS1能够降低IL-1β的表达水平。蛋白检测结果显示,应用PHPS1后,P-ERK表达水平下降,总ERK的蛋白表达水平不变。体外实验:1.ox LDL可激活小鼠主动脉平滑肌细胞的SHP2/ERK信号通路促进平滑肌细胞增殖。2.PHPS1可有效的抑制SHP2介导的平滑肌细胞的增殖;3.PHPS1能够抑制SHP2磷酸化水平和减降低P-ERK的表达水平。研究结论:1.PHPS1可在一定程度上减轻冠状动脉粥样硬化的形成和延缓病程进展。2.PHPS1不影响动脉粥样硬化小鼠的体重、血糖、血脂。通过降低细胞因子IL-1β的表达水平减轻炎症反应。3.PHPS1能够通过降低信号通路中P-ERK的表达水平,从而抑制血管平滑肌细胞细胞的增殖。4.SHP2介导血管平滑肌细胞增殖与ERK通路级联活化相关5.PHPS1在体外可抑制由SHP2介导的血管平滑肌细胞的增殖。6.PHPS1可以降低SHP2介导的ERK的磷酸化水平而抑制血管平滑肌细胞的增殖。
【关键词】：动脉粥样硬化 SHP2 PHPS1 IL-1β P-ERK
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 SHP2抑制剂PHPS1干预小鼠动脉粥样硬化的研究13-31
• 前言13-14
• 一、试剂和材料14-17
• 二、实验方法17-21
• 三、实验结果21-27
• 四、讨论27-30
• 五、小结30-31
• 第二部分 探讨SHP2抑制剂PHPS1对血管平滑肌细胞增殖作用及分子机制31-41
• 前言31-32
• 一、试剂和材料32-33
• 二、实验方法33-34
• 三、实验结果34-38
• 四、讨论38-40
• 五、小结40-41
• 综述41-47
• 一、炎性反应与动脉粥样硬化的形成41-43
• 二、炎性反应的触发43-44
• 三、炎症反应与疾病44-46
• 四、炎症反应标记物与心血管事件的预防46-47
• 结语47-49
• 参考文献49-60
• 在读期间发表论文及获奖情况60-61
• 致谢61-62

【共引文献】

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本文编号：931857