全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合GDNF、ChABC移植对脊髓损伤修复的研究

发布时间：2017-09-27 23:24

  本文关键词：全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合GDNF、ChABC移植对脊髓损伤修复的研究

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【摘要】：目的:观察1.0μmol/L全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)干预培养鼠胚神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)、硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)共同移植至大鼠脊髓横断损伤部位后,移植神经元存活情况和大鼠神经功能障碍恢复情况。方法:ATRA(1.0μmol/L)干预胎鼠脑组织神经干细胞的培养由本课题前期实验完成并冻存。移植前行冻存细胞复苏,并于移植前1d用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu-2-deoxy-uridine,Brd U)标记。雌性Sprague-Dawleg(SD)大鼠60只,体重210~250g,随机分为假手术组(A组,n=12)、损伤对照组(B组,n=12)、NSCs联合GNDF移植组(C组,n=12)、NSCs联合Ch ABC移植组(D组,n=12)、NSCs联合GDNF+Ch ABC移植组(E组,n=12)。大鼠均采用2%戊巴比妥钠(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉。损伤对照组、移植组大鼠于T10平面显露并横断脊髓、蛛网膜下腔留置PE-10导管。假手术组仅行椎板切除、硬脊膜显露和蛛网膜下腔留置PE-10导管,不损伤脊髓。术后第8d,C、D、E组大鼠微量注射器注入Brd U标记NSCs 10μL(细胞浓度:2×105个/μL),A、B组缓慢注射生理盐水10μL对照。C组继续注射GDNF 10μL(10ug/m L)、生理盐水10μL(共20μL/d,连续7d),D组注射Ch ABC 10μL(5U/m L)、生理盐水10μL(共20μL/d,连续7d),E组注射GDNF 10μL(10ug/m L)、Ch ABC 10μL(5U/m L)(共20μL/d,连续7d);A、B组大鼠通过微量注射器经留置导管注射生理盐水20μL/d,连续7d。每组大鼠于术前1d、术后7d、末次推注细胞因子后1、2、5、8w各时间点,采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分评估大鼠双后肢运动功能,采用体感诱发电位(Somatosensory evoked potentials,SEP)评估脊髓损伤后神经传导功能恢复情况。建模术前BBB评分小于21分大鼠被排除本研究。移植8w后,大鼠再次采用戊巴比妥钠(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉,生理盐水和4%中性多聚甲醛磷酸盐缓冲液经心脏灌注固定。沿原切口暴露损伤脊髓并取损伤节段脊髓组织行HE染色观察损伤区域改变;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine,Brd U)、胶质纤维蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗体行免疫组织荧光双标染色观察移植NSCs细胞存活以及轴突生长情况。统计学分析采用SPSS19.0系统软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验进行分析,P0.05为差异具有统计学意义。结果:(1)后肢功能障碍BBB评分结果:术后7d,损伤对照组、移植组BBB评分较假手术组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);损伤对照组、移植组各组之间比较,BBB评分差异不具有统计学意义(P0.05);在移植2w后,移植组大鼠双侧后肢功能障碍逐步恢复,BBB评分较损伤对照组高,差异具有统计学意义(P0.05);在移植5w后,大鼠后肢功能障碍以E组恢复最好,BBB评分较C、D组高,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)SEP潜伏期评估结果:手术建模术后7d时,损伤对照组、移植组大鼠SEP潜伏期较假手术组明显延长,差异具有统计学意义(P0.05),损伤对照组、移植组组间SEP潜伏期比较,差异不具有统计学意义(P0.05)。末次移植2w后,各移植组大鼠SEP潜伏期开始缩短,移植组与损伤对照组比较差异具有统计学意义(P0.05);移植5w后,E组SEP潜伏期较C、D组缩短更为明显,差异仍具有统计学意义(P0.05)。(3)HE染色观察:假手术组大鼠灰、白质分界清楚,神经纤维束排列规则,细胞轮廓清楚、结构完整;损伤对照组损伤区血管形态欠完整,细胞排列紊乱,可见囊腔及胶质瘢痕形成;移植组损伤区域细胞增生明显,胶质瘢痕形成,胶质瘢痕周围见细胞增生明显,坏死空洞较损伤对照组明显缩小。(4)免疫组织荧光双标染色观察及阳性细胞计数结果:A、B组未见Brd U标记阳性细胞表达,移植组见Brd U阳性细胞存活。Brd U阳性细胞计数:C组平均95.2±10.2个,D组平均92.7±8.9个,E组平均109.0±10.8个,E组细胞计数较C、D组多,差异具有统计学意义(P0.05)。GFAP阳性细胞计数:C组平均13.5±2.5个,D组平均12.9±1.9个,E组平均10.3±2.1个,E组GFAP阳性细胞较C、D组少,差异具有统计学意义(P0.05)。MAP-2免疫组织荧光染色阳性细胞计数提示,C组平均11.7±2.2个,D组平均10.6±2.4个,E组平均14.1±2.3个,E组阳性细胞计数多于C、D组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.经ATRA干预培养的NSCs移植可促进大鼠损伤脊髓功能恢复;2.经ATRA干预的NSCs联合GDNF、Ch ABC因子移植对大鼠损伤脊髓功能障碍恢复较ATRA干预NSCs分别联合GDNF、Ch ABC临床效果更佳;3.GDNF、Ch ABC在NSCs移植治疗大鼠脊髓损伤过程中具有协同作用。
【关键词】：神经干细胞 胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) 硫酸软骨素酶ABC 脊髓损伤 联合移植
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-25
• 结果25-29
• 附图29-35
• 讨论35-40
• 结论40-41
• 参考文献41-47
• 英汉缩略词对照表47-48
• 致谢48-49
• 神经干细胞、GDNF和Ch ABC在脊髓损伤治疗过程中的作用及研究进展（综述）49-61
• 参考文献56-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 柴宏伟;朱涛;;硫酸软骨素酶ABC治疗脊髓损伤的研究进展[J];国际神经病学神经外科学杂志;2008年05期

2 傅强,侯铁胜,鲁凯伍,李明,石志才,赵杰;大鼠胸段脊髓损伤后后肢运动功能不同评价标准的比较研究[J];中国脊柱脊髓杂志;2001年05期

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本文编号：932521