黄芩苷对糖尿病肾病大鼠肾脏缝隙连接蛋白43磷酸化的影响

发布时间：2017-09-28 18:17

  本文关键词：黄芩苷对糖尿病肾病大鼠肾脏缝隙连接蛋白43磷酸化的影响

  更多相关文章： 黄芩苷 糖尿病肾病 蛋白激酶C 缝隙连接蛋白43磷酸化

【摘要】：目的糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最常见和最严重并发症之一,其发病机制复杂。本实验通过研究黄芩苷对DN大鼠肾脏缝隙连接蛋白43磷酸化(p-Cx43)介导的缝隙连接(GJ)通讯功能影响,来探讨GJ通讯在DN发生发展中的作用机制,为中医药防治DN开辟新道路。方法(1)动物实验,在SPF环境下,饲养雄性SD大鼠70只,周龄8w,体重约180-220g。所有动物先适应饲养两天,接着随机分10只为正常组和60只为DN造模组。正常大鼠给与普通饲料饲养,造模大鼠给与高脂饲料饲养。一个月后,造模大鼠给与单次腹腔注射1%链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),注射量按35mg/kg计算,同时,正常大鼠腹腔注射按此计量折算出的浓度为0.1mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,注射前全部大鼠均禁食不禁水12h。5-7天后,采取剪尾取血法来测随机血糖,测得随机血糖值≥16.7 mmol/L,则糖尿病(DM)大鼠造模成功。此后,所有大鼠继续给与普通饲料饲养,8周后,若DM大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L,尿蛋白出现阳性,24h尿量大于正常组的50%,则诊断糖尿病肾病模型(Diabetic Nephropathy,DN)成功。将DN大鼠分成模型组、黄芩苷组和依那普利组,并分别以蒸馏水2ml/kg/d,黄芩苷0.16g/kg/d,依那普利1.05mg/kg/d进行灌胃,6周末,所有大鼠称重测血糖,麻醉后断头处死,取出双肾,剔除包膜,左肾放入10%中性甲醛液中固定,病理HE常规法观察肾脏病理改变,免疫组化法检测蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)与缝隙连接蛋白43磷酸化(p-Cx43)表达,右肾放到液氮中速冻后-80℃保存,用Western blot法检测Cx43的磷酸化表达。(2)在细胞水平,采用低糖浓度(5.5mmol/L,LG),高糖浓度(25mmol/L, HG),高糖+黄芩苷(100μmol/L),高糖+依那普利(100μmol/L),分别和HK-2共同培养,并观察24h、48h、72h三个不同时间点细胞的增殖变化,运用MTT法检测各组HK-2的生长状况。结果(1)血糖值给药前,所有DM大鼠血糖都明显高于正常大鼠,比较差异,有统计学意义(P0.05)。给药后,黄芩苷组、依那普利组血糖值较模型组降低,比较差异,有统计学意义(P0.05)。且黄芩苷较依那普利降糖更明显。(2)肾指数治疗后,模型组、黄芩苷组和依那普利组三组大鼠肾指数均比正常组高,差异有统计学意义(P0.05)。同时,黄芩苷组和依那普利组肾指数比模型组均低,比较差异,无统计学意义(P0.05),且黄芩苷组较依那普利组略低。(3)肾脏病理观察治疗后,模型组、黄芩苷组和依那普利组大鼠肾小球体积增大,肾系膜细胞有增生,肾小管上皮细胞水肿,与正常组有明显区别。同时,黄芩苷组与模型组比较,肾脏病变减轻,且治疗效果优于依那普利组。(4)肾脏PKC表达正常组肾小管上皮细胞膜未见PKC表达。模型组肾小管上皮细胞膜可见PKC棕黄色颗粒,为强阳性表达。黄芩苷组和依那普利组较模型组PKC棕黄色颗粒数量明显减少,着色程度减轻,为中度阳性表达。且黄芩苷组较依那普利组PKC阳性表达更低。(5)肾脏p-Cx43表达正常组肾小管上皮细胞膜可见p-Cx43弱阳性表达。模型组肾小管上皮细胞膜可见p-Cx43棕褐色颗粒,为强阳性表达。黄芩苷组和依那普利组较模型组p-Cx43棕褐色颗粒数量明显减少,着色程度减轻,为中度阳性表达。且黄芩苷组p-Cx43阳性表达较依那普利组减弱。另外,肾脏p-Cx43蛋白表达的结果也同肾小管上p-Cx43阳性表达的趋势一致。(6)平均增殖率分别测定HK-2在24h,48h,72h的生长情况,发现高糖环境下HK-2细胞生长呈双重效应,高糖干预24h,细胞增殖增加；高糖干预48-72h,细胞明显受到抑制,抑制率和时间成正比。黄芩苷干预后,随着时间增加,细胞呈时间依赖性出现增殖现象,与模型组比较有统计学差异(P0.05),且增殖效果优于依那普利组。结论黄芩苷对高糖环境下糖尿病肾脏有改善作用。在动物水平,黄芩苷能减轻DN大鼠肾脏结构和功能损伤,并能改善肾脏缝隙连接通讯功能,其机制可能与其下调DN大鼠肾组织PKC和p-Cx43表达相关；在细胞水平,高糖能诱导HK-2生长受到抑制,黄芩苷可以促进高糖环境下HK-2的增殖,且呈时间依赖性。
【关键词】：黄芩苷 糖尿病肾病 蛋白激酶C 缝隙连接蛋白43磷酸化
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 第一章 研究背景11-18
• 第一节 传统中医对糖尿病肾病病因病机研究11-12
• 一、DN的病名研究11
• 二、DN的病因病机研究11-12
• 第二节 现代医学对糖尿病肾病发病机制探究12-13
• 第三节 缝隙连接蛋白43与DN关系13-15
• 一、Cx43的结构和功能13-14
• 二、Cx43与DN关系14-15
• 第四节 糖尿病肾病治疗现状研究15-18
• 一、西医治疗DN研究现状15-16
• 二、中医治疗DN研究现状16
• 三、黄芩苷对DN疗效研究16-18
• 第二章 实验方法18-42
• 第一节 黄芩苷改善大鼠糖尿病肾病药效学研究18-27
• 一、材料与仪器18-19
• 二、实验方法19-20
• 三、结果20-22
• 四、讨论22-27
• 第二节 黄芩苷改善大鼠糖尿病肾病相关机制研究27-35
• 一、材料与仪器27-28
• 二、实验方法28-31
• 三、结果31-32
• 四、讨论32-35
• 第三节 黄芩苷对高糖环境下人肾小管上皮细胞(HK-2)的增殖影响35-42
• 一、材料与仪器35-36
• 二、实验方法36-39
• 三、结果39
• 四、讨论39-42
• 结语42-43
• 一、实验结论42
• 二、实验意义42
• 三、存在不足42-43
• 参考文献43-50
• 附录50-57
• 附录1：论文中使用的缩略语50-52
• 附录2：肾脏HE病理检测及免疫组化检测52-57
• 在校期间发表论文情况57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王晶晶;陈江华;;DAG/PKC信号通路和糖尿病肾病[J];国际泌尿系统杂志;2006年06期

2 林锐珊;赵平;吴绍锋;罗海燕;伍趣京;苏宁;;黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞缝隙连接蛋白43表达的影响[J];安徽中医学院学报;2013年06期

3 郑国静,常瑜,程益春;糖尿病肾病的中医治疗思路和方法[J];湖北中医杂志;2004年01期

4 刘海霞;郭明好;刘云;朱永俊;刘向东;许清玉;谭静;;黄芩苷对人肾小管上皮细胞转分化的影响[J];中国中西医结合肾病杂志;2011年10期

5 韩喻美，，晏金平;黄芩甙类对海人酸所致神经毒性的抑制效应[J];江西医学院学报;1995年01期

6 张玉领;孙长颢;;2型糖尿病动物模型的研究进展[J];实用糖尿病杂志;2011年04期

7 冷冬;;MTT法简介及在兽医临床上的应用展望[J];现代畜牧兽医;2012年04期

8 徐维佳;牟姗;王琴;施蓓莉;顾乐怡;倪兆慧;;黄芪甲苷对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用[J];中国中西医结合肾病杂志;2012年09期

9 朱海峰;;自拟方中药保留灌肠治疗糖尿病肾病Ⅳ期疗效观察[J];海峡药学;2014年11期

10 尚媛媛;马克涛;李丽;司军强;;缝隙连接与糖尿病[J];现代生物医学进展;2010年22期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 赵平;黄芩苷下调NF-κB表达抑制高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的研究[D];广州中医药大学;2012年

2 聂琳;高糖、AngⅡ对小鼠足细胞凋亡及PKC活性、nephrin、CD2AP表达的影响[D];山西医科大学;2012年

本文编号：937350