细胞分裂调节蛋白1（PRC1）的表达对前列腺癌临床进展及预后的预测意义

发布时间：2017-10-17 07:37

  本文关键词：细胞分裂调节蛋白1（PRC1）的表达对前列腺癌临床进展及预后的预测意义

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【摘要】：研究背景和目的：作为欧美等西方国家最为常见的恶性肿瘤之一,前列腺癌的致死率在男性肿瘤中高居第二位,每年在全世界范围内有超过90万人被诊断为新发的前列腺癌。在2015年,美国前列腺癌新发病例数达到220800例,占男性恶性肿瘤新发病例数的26%,高居第一位,死亡病例数为27540例,占男性恶性肿瘤死亡人数的9%,是美国男性恶性肿瘤第二大死因。相对于欧美等发达国家来说,中国前列腺癌发病率较低,但近年来随着生活条件的改善、饮食结构的改变、人口的老龄化进程的加快,我国前列腺癌发病率、死亡率均有明显提升,据相关统计,上海1997-1999年前列腺癌的发病率较1985-1987年增加了3.5倍。随着诊断和治疗技术的发展,大部分前列腺癌患者在早期就接受了根治手术或者去势治疗,治疗延长了生命,但是在这些患者中,术后约有20%-50%出现了生化复发(BCR Biochemical recurrence),而补救性治疗(放疗、化疗、冷冻、消融)的效果均不理想。在现今的前列腺癌预后相关指标的研究方面,PSA、Gleason、 TMN分期、激素受体、切缘阳性等指标已经被用于预测术后前列腺癌的生物学行为。上述指标提高了人们对前列腺癌根预后的预见性,可惜这些指标无论是单独还是联合都不能准确地诊断复发及转移。所以在肿瘤分子生物学领域寻找更多、更特异的、有助于预测前列腺癌预后的病理或生化指标就显得尤为迫切了。在前列腺癌分子生物学研究领域尤其是基因组学领域中,近年来经过多位学者的努力,一批与前列腺癌发生发展密切的基因逐渐涌现出来,其中多个与细胞周期(Cell cycle progression, CCP)相关的基因被证实与前列腺癌术后的预后相关,而且其中31个CCP基因已经被挑选出来构建成CCP评分模型并用于预测根治术后前列腺癌细胞的生物学行为,这个模型的有效性已经得到证实。细胞质分裂调控蛋白1(Protein regulator of cytokinesis 1 PRC1)是31个CCP基因之一,该基因主要在G2/M期表达,但是当细胞进入G1期或退出有丝分裂后PRC1蛋白表达明显就会下降。既往研究表明PRC1直接受抑癌基因P53的负性调控,而且在乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等肿瘤的研究中PRC1都被作为恶性增殖标志和治疗的靶标,但是PRC1与前列腺癌预后的研究尚无报道。在本研究中,我们首先通过复习文献了解PRC1在肿瘤进展过程中的角色,随后在前列腺癌细胞株中用QPCR及Western blot的方法证明PRC1在mRNA及蛋白水平表达上调。接下来在前列腺癌组织芯片中利用免疫组化的方法分析癌组织和非癌组织中PRC1的表达的差异,进一步在基因芯片数据库—Taylor数据库(NCBI GEO accession:GSE21032)中分析mRNA水平该基因在癌组织和非癌组织的表达情况,综合分析了RC1与前列腺癌病理特征之间的相关性。最终联合目前常用的临床指标如PSA、Gleason评分等构建前列腺癌的预测模型,在统计学上说明了PRC1与前列腺癌进展、预后尤其是生化复发的相关性。实验材料为了挑选与前列腺癌进展密切相关的基因,我们在Taylor数据库(NCBI GEO accession no:GSE21032;该数据库包括179例临床样本和细胞株相应的microRNA及mRNA的表达谱芯片数据)对31个与前列腺癌根治术后预后密切相关的CCP基因进行筛选,进一步分析相关文献挑选出本研究的目的基因PRC1。同时整理了Taylor数据库中前列腺原位癌(150例)和前列腺癌旁组织(29例)的临床病理、术后随访等信息,用于统计分析。本研究使用的细胞株(PC3、Lncap、BPH-1)购自美国ATCC。细胞株mRNA提取试剂(Invitrogen,Madison,USA)、PRC1基因逆转录试剂购自(TakaraBiotechnology),蛋白提取试剂、Western blot实验试剂购自于sigamao免疫组织化学分析使用的组织芯片购自于上海(Shanghai Outdo Biotech Co,LTD(Cat No:HPro-Adel 80PG-01))该芯片包含99例前列腺原位癌组织及81例前列腺癌旁组织,每一例标本都附带该患者相应的临床信息,且所有患者术前均没有接受过化疗及放疗。实验方法：1.细胞培养：前列腺癌细胞株PC3及LNCAP、前列腺增生细胞BPH都购自ATCC,细胞在含有10%胎牛血清和1%的双抗的培养基培养,培养箱调节至37℃,5%的二氧化碳。2. 实时定量PCR (QPCR):按照试剂盒步骤从前列腺增生细胞和前列腺癌细胞中提取总RNA,取2ug总RNA进行逆转录,采用20ul体系进行实时荧光定量,QPCR使用RotorGene 2000 system(Corbett Research,Mortlake,Australia)进行,数据分析使用Rotor-Gene v5.0(Corbett Research),操作方法参照仪器所附带的实验方案。3. Western blot:从前列腺增生细胞和前列腺癌细胞中提取蛋白,取2ug蛋白在SDSPAGE胶电泳并转移至杂交硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉溶于TBST封闭1小时,随后将膜洗干净,按照1：2000的比例稀释PRC1抗体(rabbit monoclonal antibody,ab51248,Abcam Co Ltd.,USA)及β-actin抗体(sc-47778,Santa Cruz,USA),整夜孵育,使用SuperSignal West PICO的化学发光检测系统观察结果,选择β-actin作为内参蛋白。4. 免疫组化分析：10%中性福尔马林保存临床样本后进行石蜡包埋,组织被切成厚度为4um的切片,随后二甲苯脱去石蜡、水化(DAKO EnVision System (Dako Diagnostics, Switzerland).蛋白酶消化并阻断内源性过氧化物酶,按1：200的比例稀释一抗体((rabbit monoclonal antibody, ab51248, Abcam Co Ltd., USA),4℃冰箱中整夜孵育一抗。第二日洗净切片,使用辣根过氧化物标记的多聚物进行标记、色原体基质处理发现目标蛋白的染色情况,实验中空白对照不加一抗处理。在苏木素复染后,由两位病理医生独立地对组织的免疫染色情况进行评分,这两位医师不知道患者的诊断及预后。随后对两组评分数据进行比较,任何标本的评分出现差异都要重新评估,直到两位病理医师的评分达到一致时,免疫染色评分才算完成。具体评分方法如下：(在显微镜下取十个典型的视野并数出阳性染色细胞数,计算出阳性细胞比例,根据抗体说明书,细胞质染色即为阳性。根据染色细胞的比例(0-100%)及染色的深度(0-阴性、1-弱阳性、2-中等阳性、3-强阳性来评定每一个肿瘤组织切片目的蛋白表达水平。染色细胞比例评分及染色深度评分相加构成了最终的免疫组化评分(immunoreactivity score, IRS) 。5.统计学处理：所有实验数据均用均数±标准差表示,数据统计分析用SPSS 17.0统计软件包(SPSS Inc,IL,USA)处理。独立样本T检验结果用表示,所有2×2表格进行Fisher精确检验,对非2×2进行Pearson卡方检验,使用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验进行生存分析,Cox危险因素回归模型用于分析单因素和多因素的生存分析,当P值小于0.05时认为差异具有统计学意义。结果：a. 从CCP基因群中挑选出PRCl我们在Taylor数据库中用Kaplan-Meier plots分析了这31个CCP基因与前列腺癌生存率以及生化复发率的关系,结果显示其中10个表达上调的基因和生化复发相关。在这个列表包含的基因中,既往研究表明PRC1可能是为恶性肿瘤细胞增殖的指标。同时多项研究也报道了该基因与人类多种癌症的不良预后密切相关,故选择PRC1作为目的基因进行研究。b.PRC1在前列腺癌细胞株表达上调。QPCR及Westernblot在mRNA水平、蛋白水平证实：与前列腺良性增生细胞(BPH-1)相比,前列腺癌细胞中PRC1基因在mRNA、蛋白水平都呈现出表达上调(P0.05)。c.PRC1蛋白在前列腺癌临床标本中表达上调前列腺癌组织芯片的免疫组化结果提示PRC1蛋白主要表达部位在癌组织的胞质,在癌旁组织不表达或只是中等表达,并且PRC1蛋白在前列腺癌组织中的表达量明显高于非癌组织。(免疫组化评分(IRS)：IRS:PCa=5.56±1.624vs.Benign=4.65±1.352,P0.001d. PRC1的mRNA表达量与前列腺癌临床病理特征相关临床芯片免疫组化证实PRC1蛋白表达上调,而在Taylor基因芯片中,PRC1在前列腺癌组织中的mRNA表达量也明显高于非癌组织(PCa=6.8734±0.3802 vs. Benign=6.6129±0.1239, P0.001)。更有意义的是,PRC1的表达量增加与高Gleason评分(P=0.041),肿瘤转移的出现(P0.006),生化复发(P0.013)都密切相关,这些信息都表明PRC1和前列腺癌的临床预后存在紧密的联系。e.分析PRC1的mRNA表达量有助于预测前列腺癌的预后我们使用Kaplan-Meier在Taylor数据库中分析了PRC1基因表达量与前列腺癌患者总体生存率、生化复发率之间的联系。以PRC1表达量的中位数为分割点将前列腺癌组织分为高表达组(75例)和低表达组(75例)。对于预测前列腺癌总体生存率,PRC1高表达组和低表达组之间没有统计学差异,但在生化复发的研究中,高表达组明显更早地出现了生化复发。在COX回归分析中,单因素分析中高表达组与低表达组在生化复发时间上也表现出明显差异(HR 5.08, 95% CI 2.51-10.26; P0.001)=此外,在多因素分析结果中,表达上调的PRC1 (HR 6.23,95% CI 2.08-19.06; P=0.001)、高Gleason评分(HR 2.70,95% CI 1.69-4.33; P＜0.001、术前高PSA水平(HR 1.01,95% CI 1.00-1.01; P=0.02)都是生化复发独立的预测因子。结论：1.PRC1在前列腺癌细胞及癌组织中表达均上调,其在mRNA及蛋白质水平的上调表达有助于鉴别前列腺癌及前列腺良性组织。2.PRC1的表达上调与前列腺癌的多项病理特征相关,临床检测PRC1的表达量可以有协助预测前列腺癌的预后。3.前列腺癌患者PRC1的表达与前列腺癌根治术后生化复发相关,评估PRC1的表达有助于预测前列腺癌术后生化复发,可以协助临床医生制定个性化的治疗方案。
【关键词】：前列腺癌 PRC1 临床病理特征 生化复发 预后
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-40
• 1.1 前列腺的解剖结构17-18
• 1.2 前列腺癌的流行病学概述18-21
• 1.3 前列腺癌分子生物学研究概述21-23
• 1.4 前列腺癌进展相关分子生物学变化23-24
• 1.5 前列腺癌诊断24-29
• 1.6 前列腺癌治疗29-31
• 1.7 前列腺癌生化复发(BIOCHEMICAL RECURRENCE)31-33
• 1.8 细胞周期进展基因与肿瘤预后(CELL CYCLE PROGRESSION SCORE)33-36
• 1.9 PRC1基因概述36-38
• 1.10 本研究拟解决的问题38-40
• 第二章 实验材料与方法40-56
• 2.1 实验材料40-44
• 2.2 实验主要试剂44
• 2.3 实验主要溶液配制44-46
• 2.4 实验仪器46-47
• 2.5 实验方法47-54
• 2.6 前列腺癌基因芯片数据库(TAYLOR数据库)54-55
• 2.7 统计学处理55-56
• 第三章 结果56-63
• 3.1 从CCP基因群中挑选出PRC156
• 3.2 PRC1的MRNA在前列腺癌细胞株中高表达56-57
• 3.3 前列腺癌细胞株中PRC1蛋白表达量升高57-58
• 3.4 PRC1蛋白在前列腺癌临床标本中表达上调58-60
• 3.5 PRC1的MRNA表达量与前列腺癌临床病理特征之间联系60-61
• 3.6 PRC1表达量对于前列腺诊断价值的描述61-63
• 第四章 讨论63-66
• 4.1 PRC1与前列腺癌发生相关63
• 4.2 PRC1与前列腺癌生化复发相关63-64
• 4.3 前列腺癌中PRC1可能的调控机制64-66
• 第五章 结论66-67
• 参考文献67-76
• 本研究的不足之处76-77
• 缩略词表77-80
• 攻读学位期间发表的论文80-81
• 致谢81-83

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1 罗宏伟;细胞分裂调节蛋白1（PRC1）的表达对前列腺癌临床进展及预后的预测意义[D];南方医科大学;2016年

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本文编号：1047598