小鼠睾丸3D培养体系的建立与成年小鼠精原干细胞富集方法的研究

发布时间：2017-10-21 21:52

  本文关键词：小鼠睾丸3D培养体系的建立与成年小鼠精原干细胞富集方法的研究

  更多相关文章： 睾丸 细胞外基质 精原干细胞 3D培养

【摘要】：睾丸中精子发生异常是造成男性不育的一个主要原因,在临床上主要表现为少精、无精或精子畸形。为此,我们以小鼠正常睾丸组织支架作为3D培养支架,在体外对乳鼠睾丸细胞进行长期培养,期望建立体外生产精子的技术平台。通过3D培养我们成功获得进入减数分裂时期的细胞。并且进一步研究了从成年小鼠睾丸中分离精原干细胞的方法。主要研究结果如下：1.小鼠睾丸支架的制备：采用不同浓度的SDS对周龄为4-5w的昆明白小鼠睾丸处理不同的时间制备睾丸支架,然后对制备的支架进行组织学及生物化学的检测,筛选出制备小鼠睾丸支架的最佳条件,即1% SDS处理24h。2.乳鼠睾丸细胞的制备：从出生后5-7d的乳鼠睾丸中分离睾丸细胞,然后将其注射到小鼠睾丸支架中,进行体外3D培养。通过组织学、免疫组织化学、流式细胞技术、RT-PCR等技术检测了精子发生中不同阶段的细胞特异标记基因的表达,结果表明睾丸支架能够在体外支持乳鼠睾丸细胞的分化。3.分离纯化成年小鼠精原干细胞：采用两步酶消化法分离周龄为6-8w的昆明白小鼠的睾丸细胞,然后对其进行体外培养,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、移植、RT-PCR检测和流式细胞术等一系列分析、鉴定,证明成年小鼠睾丸细胞在体外培养3d后再用MACS方法分选精原干细胞,能够显著提高精原干细胞的数量。本研究为建立更为可靠的精子体外成熟的方法探索了一条可能的新路,为研究人精子体外发生奠定了基础。
【关键词】：睾丸 细胞外基质 精原干细胞 3D培养
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 睾丸12-16
• 1.1.1 睾丸的形态结构与功能12-13
• 1.1.2 精子发生过程13-14
• 1.1.3 支持细胞14-15
• 1.1.4 精子发生的调控15
• 1.1.5 生殖细胞中的分子标记15-16
• 1.2 细胞外基质16-21
• 1.2.1 制备天然组织的ECM16-19
• 1.2.2 脱细胞后ECM的检测19
• 1.2.3 ECM中残留化学试剂的清除19
• 1.2.4 ECM作为生物支架的应用19-20
• 1.2.5 ECM的研究进展20-21
• 1.3 精原干细胞的培养21
• 1.4 SSCs体外诱导精子发生21
• 1.5 结语21-22
• 第二章 制备小鼠睾丸支架22-47
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 实验动物22
• 2.1.2 实验仪器耗材22
• 2.1.3 实验试剂22
• 2.1.4 重要溶液的配制22-24
• 2.2 实验方法24-30
• 2.2.1 小鼠睾丸脱细胞24-25
• 2.2.2 小鼠睾丸ECM组织学染色25-27
• 2.2.3 小鼠睾丸ECM生化成分测定27-30
• 2.3 实验结果30-46
• 2.3.1 小鼠睾丸ECM的组织学染色结果30-35
• 2.3.2 小鼠睾丸ECM生化成分测定结果35-46
• 2.4 讨论46
• 2.5 小结46-47
• 第三章 新生小鼠睾丸细胞3D培养与鉴定47-58
• 3.1 实验材料47
• 3.1.1 实验仪器及耗材47
• 3.1.2 实验试剂47
• 3.1.3 重要溶液配制47
• 3.2 实验方法47-52
• 3.2.1 制备睾丸支架47-48
• 3.2.2 分离乳鼠睾丸细胞48
• 3.2.3 向睾丸支架体注射乳鼠睾丸细胞48-49
• 3.2.4 3D培养后的鉴定49-52
• 3.3 实验结果52-56
• 3.3.1 组织学染色结果52-53
• 3.3.2 免疫组化染色结果53-54
• 3.3.3 流式细胞术检测结果54-55
• 3.3.4 RT-PCR基因表达检测结果55-56
• 3.4 讨论56-57
• 3.5 小结57-58
• 第四章 成年小鼠精原干细胞的分离纯化及培养58-73
• 4.1 实验材料58-59
• 4.1.1 实验仪器及耗材58
• 4.1.2 实验试剂58
• 4.1.3 重要溶液配制58-59
• 4.2 实验方法59-65
• 4.2.1 分离成年小鼠精原干细胞59-60
• 4.2.2 精原干细胞的纯化60-62
• 4.2.3 精原干细胞鉴定62-63
• 4.2.4 成年小鼠精原干细胞纯化效率提高鉴定63-65
• 4.3 实验结果65-71
• 4.3.1 细胞培养结果65-66
• 4.3.2 碱性磷酸酶染色结果66-67
• 4.3.3 免疫荧光染色结果67-68
• 4.3.4 流式细胞术检测结果68-70
• 4.3.5 RT-PCR基因表达检测结果70-71
• 4.4 讨论71-72
• 4.5 小结72-73
• 结论73-74
• 致谢74-75
• 参考文献75-79

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