维生素D受体在高糖导致的小鼠足细胞转分化中的作用

发布时间：2017-10-27 06:20

  本文关键词：维生素D受体在高糖导致的小鼠足细胞转分化中的作用

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【摘要】：背景及目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的慢性并发症和微血管病变之一,发病率在逐年攀升,其也已经为终末期肾脏病(end-stage renal disease,ERSD)的主要病因。足细胞为肾小球的脏层上皮细胞,被覆于肾小球的基底膜(glomerular basement membrane,GBM)之上,是肾小球滤过屏障的其中的主要构成之一。糖尿病肾病中肾小球病理生理方面的改变除了基底膜增厚和系膜基质的增生外,足细胞的数量和相关功能的改变在糖尿病肾病的发生发展的过程中也起到了相当重要的作用。因此DN蛋白尿的发生、发展与足细胞的转分化(EMT)及屏障功能损伤密不可分。维生素D受体(VDR)是核受体超家族的一员,广泛分布于多种组织、细胞,如肝细胞、胰岛细胞、肾小管上皮细胞及肾小球足细胞等。维生素D(VD)-VDR信号系统具有调控基因表达、钙磷代谢、细胞迁移和分化、免疫反应等多种作用,并且这些调控作用依赖于VDR的表达水平及活性。有研究表明,VDR在长期慢性肾脏病、终末期肾脏病及长期糖尿病导致的微炎症状态的患者体内有表达量减少的趋势,但关于VDR与糖尿病肾病足细胞转分化之间的关系的研究甚少。Wnt信号通路是介导足细胞发生EMT的重要通路之一。我们前期的实验结果也已证实,Wnt信号通路关键分子—糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)和β-catenin在高糖刺激下的足细胞中表达增加,导致间充质细胞标记蛋白表达增多,促进足细胞的EMT过程,使屏障功能受损。但在高糖环境中三者如何相互影响,机制不清。帕立骨化醇(Paricalcitol)是一种VDR激动剂,对肾脏有多个方面的保护作用。本实验利用VDR激动剂—帕立骨化醇在细胞水平研究VDR对Wnt信号通路关键分子的表达调控作用以及VDR对高糖造成的足细胞表型及功能损害的保护作用。方法以条件永生化小鼠足细胞(MPC-5)为研究对象。1.利用正常糖浓度条件下培养的足细胞检测维生素D受体的表达水平与足细胞表型的关系:将正常糖浓度培养条件下的足细胞分为以下三组:(1)正常糖浓度组:含5.6mmol/L葡萄糖;(2)scramble siRNA组:含5.6mmol/L葡萄糖+100pmol/LscramblesiRNA;(3)VDRsiRNA组:5.6mmol/L葡萄糖+100pmol/L VDRsiRNA。利用western blot和q RT-PCR技术在蛋白及基因水平上检测VDR、GSK-3β、β-catenin、足细胞标记蛋白podocin、nephrin以及间充质细胞标记蛋白α-SMA、MMP9的表达水平。2.VDR激动剂-帕立骨化醇对高糖导致的足细胞EMT及屏障功能损伤的缓解作用:1)帕立骨化醇对高糖造成的足细胞EMT的作用:将培养的足细胞分为正常糖浓度组、正常糖浓度加入DMSO组、正常糖浓度加入帕立骨化醇(0.1μM)组、高糖培养组、高糖浓度加入DMSO组、高糖培养加入帕立骨化醇(0.1μM)组,分别检测细胞中VDR的表达水平、足细胞标记蛋白podocin、nephrin的表达水平,以及间充质细胞标记蛋白α-SMA、MMP9的表达水平。2)帕立骨化醇对高糖造成的足细胞屏障功能损伤的作用:利用白蛋白流量检测上述各处理组的单层脏层上皮细胞的屏障功能。根据一定密度(5×103),把已经分化成熟的足细胞消化并接种于Transwell小室上层的纤维膜上,等到足细胞相互融合后,更替无血清的1640培养基使足细胞饥饿6-8小时达到同步化,然后再按照上述实验条件依次处理足细胞36小时,而后用已经灭菌的PBS液洗涤细胞两到三次,然后给Transwell小室的下部更替为1ml1640培养基,上部更替为0.3ml含有40mg/ml胎牛血清白蛋白的1640培养基,置于37度中1小时后,取下层培养液,用BCA蛋白浓度检测试剂盒来确定小室下部培养基的蛋白浓度,即白蛋白流量。3.VDR对Wnt信号通路关键分子的表达调控:(1)将培养的足细胞分为正常糖浓度组、正常糖浓度加入DMSO组、正常糖浓度加入帕立骨化醇(0.1μM)组、高糖培养组、高糖浓度加入DMSO组、高糖培养加入帕立骨化醇(0.1μM)组,分别检测细胞中GSK-3β、β-catenin的蛋白表达水平及活性。(2)验证VDR是否通过GSK-3β参与足细胞转分化:正常(5.6m M)培养条件下的足细胞:1)正常对照组:培养基含5.6m M的葡萄糖;2)GSK-3βsiRNA转染组;3)scramble siRNA转染组;4)帕立骨化醇组;5)帕立骨化醇+GSK-3βsiRNA转染组;6)帕立骨化醇+scramble siRNA转染组,36小时后利用western blot和q RT-PCR技术在蛋白及基因水平上检测VDR、β-catenin、足细胞标记蛋白podocin、nephrin以及间充质细胞标记蛋白α-SMA、MMP9的表达水平。结果1.利用siRNA干扰VDR的表达后,和正常糖浓度组相比,足细胞中VDR、podocin、nephrin的蛋白及基因表达降低(P0.05),而GSK-3β、β-catenin、α-SMA、MMP9的蛋白和基因表达增加(P0.05)。2.(1)高糖条件下VDR、podocin、nephrin的蛋白及基因表达降低(P0.05),而GSK-3β、β-catenin、α-SMA、MMP9的蛋白和基因表达增加(P0.05),经帕立骨化醇处理后VDR、podocin、nephrin的蛋白及基因表达增加(P0.05),而GSK-3β、β-catenin、α-SMA、MMP9的蛋白和基因表达降低(P0.05);(2)白蛋白流量检测显示,高糖条件下足细胞白蛋白流量增加(P0.05),经帕立骨化醇处理后,足细胞白蛋白流量降低(P0.05)。3.(1)高糖条件下足细胞GSK-3β、β-catenin蛋白及基因表达增加(P0.05),给予帕立骨化醇处理后,GSK-3β、β-catenin蛋白及基因表达减少P0.05。(2)利用siRNA干扰正常培养条件下的足细胞中GSK-3β的表达量,再加入帕立骨化醇,足细胞标记蛋白nephrin,podocin蛋白及基因表达增多(P0.05),间充质标记蛋白α-SMA,MMP9,GSK-3β和β-catenin蛋白及基因表达减少(P0.05)。结论1.VDR的缺失会导致足细胞的转分化。2.帕立骨化醇对高糖造成的足细胞损伤有缓解作用。3.VDR对Wnt信号通路关键分子GSK-3β、β-catenin有调控作用。
【关键词】：足细胞 糖原合成酶激酶3β 上皮-间充质细胞转分化 β-catenin 帕立骨化醇
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 中英文对照缩略词13-14
• 前言14-17
• 材料与方法17-30
• 结果30-38
• 讨论38-41
• 结论41-42
• 参考文献42-45
• 综述 维生素D受体在肾脏疾病中的研究现状45-58
• 参考文献53-58
• 个人简历及在校期间发表的学术论文58-59
• 致谢59

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本文编号：1102284