人1α羟化酶的酿酒酵母表达及其活性研究

发布时间：2017-11-23 09:17

  本文关键词：人1α羟化酶的酿酒酵母表达及其活性研究

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【摘要】：目的:构建人1α羟化酶的真核表达载体,在酿酒酵母中进行诱导表达,研究其蛋白的表达及酶活性。为进一步探索重组蛋白1α羟化酶在CKD-MBD的治疗中的应用提供了新的启示。方法:1.根据GenBank数据库已知的1α羟化酶(AK314953)的基因序列,由长沙鹏远生物有限公司进行生物合成,得到基因片段CYP27B1。2.依据GenBank上已知的该基因序列设计特异性引物,经PCR扩增,回收和纯化后,将目的基因CYP27B1和质粒pYES2/CT分别进行双酶切,回收和纯化后,再将已酶切的目的基因CYP27B1与已酶切的质粒pYES2/CT连接,构建成重组质粒pYES2/CT-CYP27B1,转化至大肠杆菌TOP10,筛选测序鉴定。3.提取鉴定成功的重组质粒pYES2/CT-CYP27B1,以醋酸锂法转化酿酒酵母菌INVSc1,筛选鉴定。4.将含重组质粒的酿酒酵母菌INVSc1,加入半乳糖诱导重组蛋白CYP27B1的表达,同时设计空载组对照,SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行分析、鉴定。5.将表达目的蛋白的酿酒酵母表达菌INVSc1于含特定浓度25羟维生素D的诱导培养基中培养24小时,同时设计空载组、酿酒酵母组对照,进行体外转化实验,鉴定其酶活性。结果:1.以1α羟化酶(AK314953)的基因序列为模板,通过PCR扩增获得一约1.527Kb大小的目的片段,与Genbank上1α羟化酶基因片段大小符合。2.构建的含重组质粒pYES2/CT-CYP27B1的大肠杆菌,经菌液PCR、HindIII及Eco RI双酶切及测序鉴定,结果显示与Genbank上1α羟化酶基因序列完全一致。3.利用醋酸锂转化法成功将重组质粒pYES2/CT-CYP27B1转化酿酒酵母菌INVSc1,经菌落PCR扩增获得一约1.527Kb大小的目的片段,与目的基因片段大小符合。4.重组酿酒酵母菌INVSc1经不连续SDS-PAGE分析结果显示:酿酒酵母表达菌INVSc1成功表达了一相对分子质量约为72KDa的目的蛋白,与理论相符合,且目的蛋白在表达菌中以可溶性蛋白的形式表达;Western Blot分析结果显示:在约72KDa处有一特异性条带,与预期蛋白相对分子质量相符合。5.体外转化实验结果:诱导培养基中的25羟维生素D经酿酒酵母基因工程菌分解后浓度明显下降,与空载组、酿酒酵母组相比,差异具有统计学意义(P0.05),证实重组蛋白1α羟化酶具有酶活性。结论:人1α羟化酶基因成功构建到酿酒酵母菌INVSc1中,能表达1α羟化酶,并具有酶活性。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

【参考文献】

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本文编号：1217958