高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞Cbfa1及Sox9动态变化的研究

发布时间：2018-01-30 14:17

  本文关键词： β-甘油磷酸 血管平滑肌细胞 表型转化 核心结合因子a1 性别决定区Y-box9　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：高磷是慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）患者心血管事件十分重要的非传统危险因素，血管钙化的存在及其程度则是心血管事件的独立预测因子。而CKD患者的血管钙化以中膜的钙化为突出表现。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管中膜最主要的细胞成分，其发生类成骨/成软骨样的表型转化是血管钙化的关键环节，其特点是出现骨源性基因的表达上调，尤其是核心结合因子a1（corebinding factor a1, Cbfa1）和性别决定区Y-box9（sex determine regionY-box9, Sox9）被视为表型转化的标志物，但关于其表型转化的具体方向尚未有明确定论。本研究旨在通过体外模拟高磷环境刺激大鼠VSMCs，观察表型转化相关基因表达的动态变化，进而探讨VSMCs的表型转化方向，为高磷诱导的CKD患者血管钙化发生机制的阐明和防治提供一定的理论基础。 方法： 1血管平滑肌细胞的培养与鉴定 去除血管外膜及内膜后，采用组织块贴壁法对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行原代培养，使其经传代自然纯化，并通过形态学及免疫细胞化学的方法对其进行细胞鉴定。 2实验分组及处理 将生长状态良好的对数期VSMCs随机分为空白对照组、高磷组（HP组）及膦甲酸钠（phosphonoformic acid, PFA）组，空白对照组培养基为含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的低糖DMEM培养基，HP组为10%FBS+10mmol/L β－甘油磷酸的高磷培养基，PFA组为10%FBS+10mmol/L β－甘油磷酸+1mmol/L PFA的PFA培养基，每24h更换一次培养基。检测给予刺激后6h、12h、1d-5d中表型转化相关基因的动态表达情况。 3高磷诱导后相关基因mRNA的表达情况 应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定空白对照组及HP组不同时间点VSMCs中Cbfa1、Sox9、II型胶原a1（type II collagen a1, ColIIa1）、X型胶原a1（type X collagen a1, Col Xa1） mRNA的表达情况，以GADPH为内参，所有基因均采用同管扩增。 4HP组及PFA组Cbfa1的表达情况 应用RT-PCR及Western blot法测定HP组及PFA组不同时间点VSMCs中Cbfa1在mRNA及蛋白水平的表达情况。 5统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行统计学分析，实验结果用均数±标准差（x s）表示，两组间均数的比较采用t检验，，多组间均数的比较采用单因素方差分析（ANOVA），多组间均数两两比较采用S-N-K检验（Student-Newman-Keuls, SNK）。以P0.05为差异有统计学意义。 结果： 1VSMCs原代培养 原代培养3d即可见组织块边缘有细胞爬出，约6～7d后融合成片，即可传代。倒置相差显微镜检观察，细胞呈星型或不规则形，以梭形为主，可相互重叠生长，可见典型的束状排列和“峰-谷”样生长。HE染色：镜下可见细胞胞浆丰富，细胞核大，呈圆形或椭圆形，可见一个或多个核仁。免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），可见在细胞胞浆内有强阳性表达，免疫反应产物呈棕黄色，沿着细胞长轴呈细丝状排列，98%以上细胞可见强阳性表达。 2HP组表型转化相关基因mRNA的表达情况 随着高磷诱导时间的延长，Cbfa1mRNA的表达呈先上升、后下降、而后再次升高的趋势（P0.05），即其表达变化呈“峰-谷-峰”样，且分别于6h和3d达到峰值；而Sox9则仅在1d时达峰，呈“单峰”，且其达峰时间处于Cbfa1的谷值和第二峰值之间。而作为Sox9下游基因的II型胶原a1的变化与之类似，呈“单峰”（P0.05）；而作为Cbfa1下游基因以及肥厚软骨细胞标志物的X型胶原a1则在初期维持基础的低水平，而在Cbfa1第二次出现峰值后表达显著升高（P0.05）。 3HP组和PFA组Cbfa1mRNA和蛋白的表达情况 随着高磷刺激时间的延长，Cbfa1mRNA和蛋白的表达均呈“双峰”样（P 0.05），分别于6h及3d达峰；而PFA组则表现为第二高峰前移，分别于6h及1d达峰（P 0.05），且第二峰值低于第一峰值（P 0.05）。 结论: 1高磷刺激大鼠VSMCs后Cbfa1、Sox9及其下游基因mRNA的动态变化符合软骨细胞分化的特点，进而推测高磷可能诱导大鼠VSMCs发生了类似软骨细胞样的表型转化。 2用PFA抑制大鼠VSMCs对磷的摄取后Cbfa1表达的第二高峰前移，可能对抑制VSMCs表型转化后的进一步分化起一定作用。
[Abstract]:Objective: high phosphorus is a chronic kidney disease (chronic kidney, disease, CKD) of cardiovascular events in patients with very important non traditional risk factors exist, and the degree of vascular calcification is an independent predictor of cardiac events. CKD patients with vascular calcification in membrane calcification is prominent. Vascular smooth muscle cells (vascular smooth muscle cells, VSMCs) is the main component of cell membrane of blood vessels, the osteoblast like phenotype / cartilage like transformation is the key link of vascular calcification, which is characterized by increased osteogenic gene expression, especially the core binding factor a1 (corebinding factor a1, Cbfa1) and Y-box9 (sex determining region sex determine regionY-box9, Sox9) was considered a sign of phenotypic changes, but on the specific direction of the phenotype has not been clearly determined. The purpose of this study is to simulate high phosphorus environment by in vitro stimulation in rats VSMCs, we observed the dynamic changes of gene expression related to phenotypic transformation, and further explored the direction of phenotypic transformation of VSMCs, providing a theoretical basis for the elucidation and prevention of the mechanism of vascular calcification in patients with CKD induced by high phosphorus.
Method锛

本文编号：1476441