抗前列腺癌p53AIP1基因治疗剂的实验研究

发布时间：2018-02-03 04:12

  本文关键词： 前列腺癌 基因治疗 p53AIP1基因　出处：《中国人民解放军医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：p53调节的凋亡诱导蛋白1（p53-regulated apoptosis-inducing protein1，p53AIP1）是存在于线粒体上的p53下游通过中断细胞膜电势诱导凋亡的抑癌基因。p53AIP1不仅单独对肿瘤细胞有很强的促凋亡作用，而且同时联合应用p53AIP1与p53时，两者有很好协同促凋亡作用，并且与细胞本身的p53状态无关，其促凋亡作用可能强于p53本身，并且对p53有抗性的肿瘤细胞也有促凋亡作用。前期有报道p53AIP1突变体与散发前列腺癌关系密切，大量临床前期实验证实p53抑癌基因在前列腺癌基因治疗方面作用明显。然而p53在前列腺癌中的突变率明显低于其它癌症，p53AIP1有可能成为前列腺癌治疗的潜在新靶点。 研究目的：本实验我们试图探讨p53AIP1基因对雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3M增殖、凋亡、周期、侵袭和迁移的影响，验证p53AIP1基因作为前列腺癌治疗靶基因的可能，为以p53AIP1基因为靶点治疗前列腺癌提供实验依据和借鉴。 方法： 1.根据pDC316真核载体序列，应用PCR技术在p53AIP1两端引入酶切位点，双酶切p53AIP1基因与pDC316真核载体，利用同尾酶连接法用T4连接酶将p53AIP1基因与pDC316真核载体连接，构建真核表达载体pDC316-p53AIP1，并进行双酶切、PCR及测序鉴定。 2.选取雄激素非依赖性的人前列腺癌细胞系PC-3M，通过转染试剂LipofectamineTM2000将pDC316-p53AIP1转染至PC-3M人前列腺癌细胞，通过Western blot法观测蛋白的表达；CCK-8检测PC-3M细胞增殖；流式细胞仪分析肿瘤细胞周期变化和细胞凋亡；TranswellTM实验检测肿瘤细胞的侵袭；TranswellTM实验检测肿瘤细胞的迁移等生物学行为。 3.腺病毒载体介导的基因传递由于高的转导效率和直接局部注射安全性一直是肿瘤基因治疗的载体首选，为进一步体内验证p53AIP1在前列腺癌的基因治疗方面的潜能，我们选取AdMax Adenoviral Vector System，将构建的腺病毒穿梭载体pDC316-p53AIP1和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre利用LipofectamineTM2000共转染至腺病毒包装细胞HEK293中，通过Cre-loxP重组酶系统发生定点重组，从而构建了携带p53AIP1的复制缺陷性腺病毒载体。大量扩增病毒后应用氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒；采用组织培养半量感染法进行滴度测定；利用Western Blot技术验证腺病毒感染肿瘤细胞后的表达。 结果： 1.成功构建真核表达载体pDC316-p53AIP1,通过PCR、双酶切和测序鉴定，，成功构建了真核表达载体pDC316-p53AIP1。 2. Western Blot证明转染细胞PC-3M中p53AIP1蛋白有表达；CCK-8结果显示p53AIP1的转染能抑制前列腺癌细胞PC-3M的增殖(P＜0.05)；流式细胞术检测p53AIP1可使得PC-3M细胞呈现S/G2-M阻滞(P＜0.05)且p53AIP1的转染能促进前列腺癌细胞PC-3M的凋亡(P＜0.05)；TranswellTM侵袭和迁移实验实验结果显示表达p53AIP1的PC-3M细胞的侵袭和迁移减少(P＜0.05)。 3.成功构建了携带p53AIP1复制缺陷型腺病毒，Western Blot证明转染人宫颈癌Hella中p53AIP1蛋白有表达，扩增滴度达3.5×1010pfu/mL。 结论：综上所述，通过本实验研究初步发现p53AIP1基因治疗或许能够成为雄激素非依赖性的前列腺癌的有效的治疗手段并具有很好的应用前景。但是在临床应用之前，还需要进一步探索和验证，其中作用机制和动物实验等研究是其研究的重点。因此，我们构建了携带p53AIP1复制缺陷型腺病毒载体，为接下来的实验奠定坚实的基础。
[Abstract]:Background: p53 regulates apoptosis inducing protein 1 (p53-regulated apoptosis-inducing, protein1, p53AIP1) is present in the mitochondrial p53 downstream by tumor suppressor gene.P53AIP1 and cell membrane potential disruption induced apoptosis of tumor cells is not only a separate Pro apoptotic effect is very strong, but at the same time, the combined application of p53AIP1 and p53, both have very good cooperation apoptosis, and it has nothing to do with the p53 cell itself, the apoptosis might be stronger than the p53 itself, and of p53 resistant tumor cells could also induce apoptosis. The mutant p53AIP1 has been reported closely and sporadic prostate cancer, a large number of pre clinical experiments confirmed that p53 tumor suppressor gene significantly role in prostate cancer gene therapy. However, p53 in prostate cancer and the mutation rate was significantly lower than that of other cancers, p53AIP1 has the potential to become a new target for the treatment of prostate cancer.
Objective: in this experiment, we try to explore the effect of p53AIP1 gene on androgen independent prostate cancer cell line PC-3M proliferation, apoptosis, cycle, invasion and migration in vitro, validation of the p53AIP1 gene as a therapeutic target gene of prostate cancer may, with p53AIP1 gene as a target therapy of prostate cancer and provide experimental basis and reference.
Method锛

本文编号：1486381