促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞来源微泡修复肾脏纤维化影响的研究

发布时间：2018-02-04 09:08

  本文关键词： 骨髓间充质干细胞 微囊泡 肾脏纤维化 促红细胞生成素 微小RNA　出处：《南京医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的：既往研究表明骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)在细胞和组织损伤的修复中发挥了重要作用。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)可以提升MSC在组织和器官损伤中的修复作用。MSC外泌的微囊泡(Microvesicle, MV)可以修复急慢性肾损伤。因此,进一步研究EPO对MSC外泌的MV在修复肾脏纤维化方面的影响。研究方法：收集并提取常规培养条件下MSC来源的hMV (MSC-MVs)和经过不同浓度EPO (1,10,100和500 IU/mL)共培养条件下MSC来源的MV(EPO-MVs).体外实验：转化生长因子-β1 (Transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导人肾近曲小管上皮细胞系(HK2)发生纤维化,并用MSC-MVs和EPO-MVs进行干预治疗。运用蛋白质印迹法(Western blot)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HK2细胞的表型改变,流式细胞仪检测各实验组HK2细胞的凋亡情况。体内实验：建立单侧输尿管结扎模型(UUO)的肾脏损伤模型,MSC-MVs和EPO-MVs干预治疗后通过肾脏组织病理,肾脏纤维化标志蛋白改变及肾功能指标变化来评估各实验组小鼠的肾脏功能。运用miRNA的微列阵来检测MSC-MVs和EPO-MVs内各自miRNA表达谱,寻找出其内差异表达miRNA,并运用软件进行靶基因预测。研究结果：与常规培养条件下的MSC组相比,在1-100 IU/mL EPO共培养条件下的EPO-MSC其外泌MV的含量随着EPO刺激浓度的增加呈现明显上升的趋势。1OOIU/ml EPO浓度下提取的EPO-MVs相较于常规培养条件下的MSC-MVs在体外TGF-β1诱导HK2纤维化时,EPO-MVs的干预治疗比MSC-MVs有更显著的效果。流式细胞仪检测结果显示,MSC-MVs和EPO-MVs均可一定程度上减轻由TGF-β1诱导的HK2细胞凋亡,并且EPO-MVs的效果更佳。在体内实验中,最优EPO浓度下提取的EPO-MVs在7天和14天对UUO小鼠的肾脏损伤修复中呈现了比常规培养条件下的MSC-MVs更好的治疗效果。此外,MSC-MVs和EPO-MVs的miRNA表达谱对比分析结果显示,EPO-MVs中共有212个miRNAs表达发生变化,其中有70.28%的miRNA是表达上调的(包括miR-299a-3p, miR-449b, miR-302b-5p和miRNA-200a-3p)。这些上调变化的miRNA可能是造成EPO-MVs在肾脏损伤修复作用中效果优于MSC-MVs的原因。结论：在1-100 IU/mL EPO的浓度范围内,EPO-MSC分泌的EPO-MVs浓度与EPO浓度正相关。MSC-MVs和EPO-MVs均可以在体内和体外水平治疗肾小管纤维化导致的肾脏损伤,并且EPO-MVs治疗效果更为优异。
[Abstract]:Objective: previous studies have shown that bone marrow mesenchymal Stem Cells. The erythropoietin Erythropoietin (Erythropoietin) plays an important role in the repair of cell and tissue injury. EPO can enhance the repair effect of MSC in tissue and organ injury. MSC exocrine microvesicle can repair acute and chronic renal injury. To further study the effect of EPO on the repair of renal fibrosis by MSC secreted MV. Methods: to collect and extract MSC-MVsof hMV derived from MSC under conventional culture conditions. And after different concentrations of EPO. 10. In vitro experiment: transforming growth factor- 尾 1 (TGF- 尾 1) in vitro. Transforming growth factor- 尾 1. TGF- 尾 1) induced fibrosis in human proximal tubule epithelial cell line (HK2). Western blot and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to treat the patients with MSC-MVs and EPO-MVs. Methods the phenotypic changes of HK2 cells were detected. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of HK2 cells in each experimental group. In vivo, the renal injury model of unilateral ureteral ligation model (UUO) was established. Renal histopathology was adopted after intervention of MSC-MVs and EPO-MVs. The changes of renal fibrosis marker protein and renal function indexes were used to evaluate the renal function of mice in each experimental group. The microarray of miRNA was used to detect the miRN in MSC-MVs and EPO-MVs. A expression profile. Find out the differential expression of miRNAs, and use software to predict the target gene. Results: compared with the conventional culture of MSC group. Under the co-culture condition of 1-100 IU/mL EPO, the exocrine MV content of EPO-MSC increased significantly with the increase of EPO stimulation concentration. Compared with MSC-MVs in conventional culture, EPO-MVs extracted at the concentration of EPO was induced by TGF- 尾 1 in vitro. The intervention of EPO-MVs was more effective than that of MSC-MVs. Both MSC-MVs and EPO-MVs could attenuate the apoptosis of HK2 cells induced by TGF- 尾 1 to some extent, and the effect of EPO-MVs was better. The EPO-MVs extracted at the optimal concentration of EPO showed a better therapeutic effect on the renal injury repair of UUO mice on the 7th and 14th day than that of the MSC-MVs cultured in the conventional culture condition. The comparative analysis of miRNA expression profiles of MSC-MVs and EPO-MVs showed that there were 212 miRNAs expression changes in EPO-MVs. 70.28% of the miRNA were up-regulated (including miR-299a-3p, miR-449b). MiR-302b-5p and miRNA-200a-3p). These upregulated changes of miRNA may be the reason why EPO-MVs is superior to MSC-MVs in renal injury repair. Conclusion: in 1-100 IU/mL, the effect of EPO-MVs is better than that of MSC-MVs. Within the concentration range of EPO. The concentration of EPO-MVs secreted by EPO-MSC is positively correlated with the concentration of EPO. MSC-MVs and EPO-MVs can treat renal injury caused by renal tubular fibrosis in vivo and in vitro. . And EPO-MVs treatment is more excellent.
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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本文编号：1489884