CD36介导的肾脏AA淀粉样变的机制研究

发布时间：2018-02-12 02:58

本文关键词： 肾脏AA样变 CD36 SAA 自噬　出处：《重庆医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:肾脏AA淀粉样变性(amyloidosis)是由多种慢性疾病状态所致的,突出特点是淀粉样物质在细胞内外沉积,通过各种途径诱导肾脏组织结构与功能异常。患者主要表现为肾病综合征,随病情进展晚期表现为明显肾衰竭症状,最终导致死亡。通过更好地控制炎症能明显改善其预后,但目前这个疾病的发病机制是不清楚的,更缺乏有效的治疗。脂肪酸转运酶(CD36)属于B族清道夫受体,是连接机体脂代谢和炎症的重要膜蛋白,被认为是治疗代谢性疾病的重要靶点。近年来有研究发现CD36参与了血清淀粉样蛋白A(SAA)的摄取及SAA诱导的炎性因子的分泌过程。本研究旨在探讨CD36是否参与了肾脏AA淀粉样变所致的肾脏损害及其作用机制。方法:第一部分:选取8周龄野生型(wild type,WT)小鼠,随机分为两组,0.5ml 10%酪蛋白(Casein)隔日皮下注射为实验组(Casein组),对照组(Control组)给予等量生理盐水隔日皮下注射。按上述处理15周后先常规收集小鼠24h尿液,再采集眶静脉血离心取血清,最后分离肾脏组织。SAA浓度检测采用了酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒。小鼠肾脏淀粉样变模型的确认采用了刚果红染色;实验小鼠肾脏组织CD36的表达同时采用了免疫印迹(Western blot)和免疫组化两种方法检测。第二部分:选取8周龄野生型(WT)小鼠和CD36-/-小鼠随机分为三组,0.5ml10%酪蛋白(casein)隔日皮下注射为实验组wtcasein(+)和cd36-/-casein(+),对照组wtcasein(-)给予等量生理盐水隔日皮下注射。15周常规后收集小鼠尿液、血清液及肾脏组织。检测小鼠的血尿生化指标。刚果红及高锰酸钾处理后刚果红染色观察小鼠肾脏淀粉样变及类型;透射电镜(transmissionelectronmicroscope,tem)、苏木精-伊红染色(hematoxylinandeeosinstaining,he)和masson染色观察肾脏病理改变,westernblot、q-pcr(quantitativepolymerasechainreaction)检测肾脏损害的炎症及纤维化基因的mrna和蛋白表达。第三部分:动物实验:选用第二部分的wtcasein(+)和cd36-/-casein(+)两个组的动物模型作为体内模型;电镜观察小鼠肾脏组织自噬体数量,westernblot、q-pcr检测lc3的表达。免疫荧光检测肾脏组织的lc3和aa表达及两者的共定位关系。采用westernblot法和免疫组化法检测ampk,p-ampk的表达。chip实验进一步证明了cd36与lc3的启动子调节相关。细胞实验:选取肾脏的常用的两种细胞系,即人肾脏系膜细胞(humanmesangialcells,hmcs)和人近曲小管上皮细胞(humanproximaltubularcell,hk2)。选用了小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)瞬时转染建立了cd36sirnahmcs和hk2细胞的体外模型。进一步的用saa1ug/ml处理cd36干扰的两种不同的细胞建立体外细胞aa淀粉样变模型。在saa处理状态下,用自噬检测试剂盒观察干扰cd36对肾脏细胞自噬的影响。用自噬抑制剂wortman(200nmol/l)处理hk2细胞和hmcs细胞后分别分成4组:阴性对照组(nci+saa),cd36干扰对照组(cd36i+saa),实验对照+自噬抑制剂组(nci+saa+wortman),cd36干扰对照+自噬抑制剂组(cd36i+saa+wortman)。免疫荧光检测hk2细胞内aa的沉积状况。q-pcr检测hk2细胞和hmcs细胞的炎症和纤维化基因表达情况。再用ampk抑制剂compoundc(10umol/l)分别处理hk2和hmcs细胞,将其分为4组:阴性对照组(nci+saa),cd36干扰对照组(cd36i+saa),阴性对照+ampk抑制剂组(nci+saa+compoundc),cd36干扰对照+ampk抑制剂组(cd36i+saa+compoundc)。用自噬检测试剂盒检测自噬,用q-pcr检测lc3的表达。以自噬强度和lc3的表达来评价抑制ampk活性对saa作用下hk2和hmcs的影响。结果:第一部分:casein皮下注射能上调wt小鼠血清中血清淀粉样蛋白a(serumamyloida,saa)的含量。刚果红染色和电镜结果显示casein能够诱导wt小鼠肾脏发生淀粉样变;免疫组化和westernblot结果均显示在casein诱导的淀粉样变小鼠中cd36的表达是上调的。第二部分:刚果红染色在光镜和偏振光下观察到cd36缺失能改善casein诱导的小鼠肾脏淀粉样变;而高锰酸钾处理后的刚果红染色三组均为阴性,说明了在本实验中casein所诱导的肾脏淀粉样变是aa型的淀粉样变。另外我们的透射电镜结果也可看到wtcasein(+)组小鼠肾脏有明显的淀粉样纤维沉积,而cd36-/-casein(+)组和wtcasein(-)组没有观察到。血尿检测显示wtcasein(+)组小鼠表现出明显的肾病综合征症状,即尿量增多,大量蛋白尿,明显的低蛋白血症和高脂血症等,而CD36-/-Casein(+)组小鼠肾功能有改善。HE、MASSON染色、Western blot和Q-PCR结果均显示CD36-/-Casein(+)组小鼠肾脏纤维化和炎症水平较WT Casein(+)组明显减轻。第三部分:动物实验;TEM观察到CD36-/-Casein(+)组肾小管区自噬小体较WT Casein(+)增多;CD36-/-Casein(+)组肾脏组织的AA沉积减少而LC3的表达是上调的,且AA沉积的部位和LC3表达的部位能够重叠。WT Casein(+)组较CD36-/-Casein(+)组小鼠肾脏组织内p-AMPK表达水平明显降低,且CD36-/-Casein(+)组肾脏组织LC3的表达较WT Casein(+)增高。细胞实验:同时给与SAA处理后,CD36i组较NCi组的自噬明显增加,AA积聚减少,细胞炎症和纤维化指标表达下调的;自噬抑制剂wortman处理后,NCi组和RNAi组的上述指标改变都无明显差异。另外在AMPK抑制剂Compound C的处理下NCi组和RNAi组的自噬表达明显下降,且两组无显著差异。结论:1、Casein能诱导WT小鼠肾脏淀粉样变的发生,同时伴有CD36蛋白的异常高表达。2、CD36参与了Casein诱导的小鼠肾脏AA淀粉样病变及组织损伤;CD36的缺失能够明显改善肾脏组织淀粉样纤维的沉积及肾脏损害。3、CD36的缺失可能上调自噬的产生而清除过多的SAA发挥保护肾脏的功能。4、CD36的缺失上调自噬可能与激活AMPK上调LC3的启动子活性有关。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

【参考文献】