银杏叶提取物对高磷诱导的慢性肾脏病大鼠血管钙化作用的研究

发布时间：2018-02-13 04:38

  本文关键词： 银杏叶提取物 血管钙化 血管平滑肌细胞 氧化应激 慢性肾脏病　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)患者的主要并发症之一,也是CKD患者的主要致死亡原因。血管钙化是CKD中普遍存在的临床表现,是发生心血管致死的强大的预测因素。对于血管钙化,至今仍没有公认有效的治疗方案,因此,了解CKD血管钙化发生的机制及其可能的有效防治措施,对于防治慢性肾脏病患者心血管并发症意义重大。近年来的研究表明,CKD血管钙化由血管钙化的促进与抑制因子失衡引起,其机制极为复杂,与多种危险因素相关。大量流行病学和临床研究的资料表明高磷血症是CKD患者血管钙化、血管硬度增加继而发生CVD的主要危险因素。近年来,很多中药制剂因其毒副作用少、治疗效果肯定在临床上得到了广泛应用。EGb 761是应用现代工艺获得的银杏叶标准提取物,其通过抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗凋亡、调节血管生成及功能等多个信号途径,对改善心肌缺血、内皮细胞损伤、动脉粥样硬化斑块形成具有明显的效果。然而,EGb 761对高磷介导的大鼠血管平滑肌细胞钙化有何影响尚不明确,而且EGb 761对慢性肾脏病血管钙化的影响尚未见报道。由于高磷通过增加线粒体ROS的产生促进血管平滑肌细胞向成骨细胞转分化诱导钙化,而EGb 761具有抗氧化活性,可减少线粒体ROS产生,因此我们推测,EGb 761可能通过减少线粒体ROS的产生而抑制平滑肌细胞钙化,从而对慢性肾脏病血管钙化发挥一定程度的改善作用。材料与方法为了探明EGb 761对慢性肾脏病血管钙化的作用,本研究将分为体外细胞实验和在体动物实验。第一部分以体外培养的大鼠血管平滑肌细胞为模型,通过在高磷状态下诱导其向成骨细胞分化,检测相关信号通路和成骨信号分子的表达以及细胞钙含量,观察β-磷酸甘油联合或不联合EGb 761对血管平滑肌细胞钙化的影响。第二部分通过高磷饮食诱导建立残肾大鼠慢性肾脏病血管钙化模型,给予含EGb 761的饲料进行干预,观察其对动物动脉钙化的影响,进一步探明其作用及分子机制。实验步骤如下：1.采用组织块贴壁法对大鼠主动脉血管平滑肌细胞培养并鉴定后,分组使用p-磷酸甘油、不同浓度的EGb 761于预培养7天。2.分组对细胞内钙含量、细胞内蛋白含量、碱性磷酸酶活性、线粒体活性氧自由簇含量和NF-κB活性进行测定,并定量PCR检测大鼠血管平滑肌细胞核心结合因子(Cbfa1)、α-平滑肌肌动蛋白(a-smoot muscle actin, a-SM actin) mRNA的表达情况,以判断不同浓度EGb 761在血管平滑肌细胞钙化过程中的作用。3.通过高磷诱导建立残肾大鼠慢性肾脏病血管钙化模型,并应用EGb 761进行干预16周后测定大鼠血清尿素氮、肌酐、钙、磷指标。4.用Von Kossa染色测定大鼠胸主动脉钙化的情况,并对大鼠腹主动脉钙含量进行测定,蛋白免疫印迹法检测大鼠胸主动脉上段NF-κB p65、核心结合因子α1 (Cbfα1)和a-SM actin的蛋白含量,探讨EGb 761在慢性肾脏病血管钙化中的作用。结果1.BGP钙化干预组细胞内钙含量显著高于阴性对照组(P0.01),加入不同浓度的EGb 761后,大鼠血管平滑肌细胞内钙含量降低(P0.05),而且降低程度跟加入的EGb 761呈浓度依赖性。2.高磷可诱导细胞碱性磷酸酶的高表达、上调NF-κB活性、增加线粒体ROS产生、增加Cbfa1 mRNA的基因表达、降低a-SM actin mRNA的基因表达(P0.05),在培养液中加入相应浓度的EGb 761后,碱性磷酸酶的表达下降、NF-κB活性下降、线粒体ROS减少、Cbfα1 mRNA的基因表达下降、a-SM actin mRNA的基因表达上调(P0.05),而且效果与加入的EGb 761呈剂量依赖关系。3.残肾大鼠慢性肾脏病血管钙化模型干预16周后取血化验发现血清尿素氮、肌酐、磷明显高于阴性对照组,说明5/6肾切除+高磷饮食法诱导大鼠慢性肾功能衰竭成功,但EGb 761干预组和单纯高磷饮食组之间差异无统计学意义。4.大鼠胸主动脉Von Kossa染色和腹主动脉钙含量测定证实高磷可诱导残肾大鼠慢性肾脏病血管钙化,加入EGb 761干预可以减轻血管钙化。5.EGb 761可以抑制慢性肾脏病血管钙化大鼠主动脉中NF-κB p65、cbfa1的蛋白表达,上调a-SM actin蛋白表达,抑制血管平滑肌细胞的表型转化。结论1、EGb 761可降低13-磷酸甘油诱导的大鼠动脉血管平滑肌细胞的钙化,它不但降低钙离子的沉积,而且抑制血管平滑肌细胞表型转化,具体机制与降低碱性磷酸酶的表达、减少血管平滑肌细胞线粒体活性氧自由簇的产生、下调NF-κB的活性有关。2、EGb 761通过ROS-NF-κB信号通道减少氧化应激、抑制大鼠血管平滑肌细胞向成骨细胞的转化,对慢性肾功能衰竭大鼠的血管钙化起到保护作用。但是研究发现还存在着其它信号通路参与高磷诱导血管钙化过程,EGb 761的保护机制需要更进一步的研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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本文编号：1507335