组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA通过内质网应激干预糖尿病肾病的研究

发布时间：2018-02-15 12:13

本文关键词： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸内质网应激糖尿病肾病　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetes mellitus，DM）微血管并发症之一，是产生终末期肾衰竭（end stage renal disease，ESRD）的主要原因，严重威胁人们健康。人们认为DN主要原因是肾小球基底膜细胞损伤等，但是，最近研究发现DN时肾小管上皮细胞也存在明显的病理变化。可见，DN发病机制极其复杂，需要对DN的机制及治疗方法进行研究。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核生物中与分泌途径有关的重要的细胞器，它与蛋白的折叠、转运及翻译后修饰密切相关。内质网腔对外界刺激非常敏感，在缺血、缺氧、营养物质耗竭、钙稳态失衡、氧化应激等因素刺激下ER稳态失衡，导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的产生。ERS时内质网腔内错误折叠蛋白及未折叠蛋白堆积，ER通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）激活下游信号通路进行自我调节以减轻或终止ERS，对细胞起到保护作用。然而，当刺激持久或强烈时，ERS不可逆转，则启动ERS介导的细胞凋亡途径（ER-associated death，ERAD）导致细胞凋亡。因此，以ERS为治疗靶点的研究越来越受到人们的关注。糖尿病状态下，高血糖、游离脂肪酸增多、氧化应激等均是ERS的诱发因素，而DN是糖尿病晚期的慢性并发症，这些不良因素长期持久的刺激使ERS不可逆转，最终启动ERAD并与其他细胞损伤机制串话，起到级联放大效应，引起细胞凋亡，最终导致器官的衰竭。因此，抑制ERS可能会改善DN的发生与发展。目前研究表明DN时ERS相关蛋白的表达变化比较明确，但是这些蛋白的表达调控尚不清楚。真核生物基因表达是完整复杂的网络调控过程。真核生物基因表达调控包括基因组DNA水平的调控，其中染色质结构的改变对基因组DNA水平的调控影响较大。组蛋白乙酰化修饰与染色质结构改变关系密切，可以调控基因的转录。组蛋白乙酰化参与细胞的增殖，迁移和凋亡。组蛋白乙酰化与去乙酰化作用由组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）与组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyl transferase，HAT）之间的动态平衡决定。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylases inhibitors，HDACIs）抑制HDAC，促进组蛋白乙酰化，影响基因转录活性，因此在神经退行性变，糖尿病，心血管疾病及自身免疫性疾病等方面均有广泛的研究。丙戊酸（Valproic acid，VPA）是HDACIs代表药物，可以非选择性的抑制HDAC，已有实验结果显示HDACIs对肾损伤有一定的保护作用，并有研究表明HDAC与ERS相关基因的转录有关。因此，我们推测HDACIs可能通过调控ERS相关蛋白的乙酰化水平减轻糖尿病肾损伤。本研究通过体内实验研究VPA对DN大鼠模型ERS、细胞凋亡及糖尿病肾损伤的影响，探讨了VPA是否通过ERS及细胞凋亡干预DN；通过体外实验研究了VPA对高糖诱导大鼠NRK-52E细胞的ERS及细胞凋亡的影响；并在NRK-52E细胞和DN大鼠模型中初步探讨VPA对DN的作用是否通过调控ERS相关基因的乙酰化水平从而影响基因的转录实现的。方法：在体内实验中通过给予Wistar大鼠注射STZ后继续高脂饲养22周，诱导形成DN模型,而后给予VPA灌胃8周后取材。对DN大鼠模型进行了生化代谢指标检测、组织病理学形态及透射电镜检查明确VPA对DN大鼠模型肾损害的影响。采用免疫组化、免疫荧光及Western blot的方法检测了ERS相关蛋白GRP78、CHOP及Caspase12的蛋白表达明确VPA对DN大鼠模型ERS的影响。采用TUNEL法检测细胞凋亡率及Western blot的方法检测相关凋亡蛋白P-JNK，ATF4，Bcl-2，Bax，cleaved-Caspase3的蛋白表达明确VPA对DN大鼠模型细胞凋亡的影响。在体外实验中，选择大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞系进行细胞培养。用MTT法确定VPA的使用浓度。用Western blot方法检测了ERS相关蛋白GRP78、CHOP及Caspase12的蛋白表达。采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测NRK-52E细胞的细胞凋亡率及用Western blot方法检测相关细胞凋亡蛋白P-JNK、ATF4、 Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3的表达水平。用比色法检测VPA在高糖诱导NRK-52E细胞及DN大鼠模型中组蛋白H4总乙酰化水平，用CHIP法检测VPA在高糖诱导NRK-52E细胞及DN大鼠模型中ERS相关蛋白GRP78及CHOP基因启动子组蛋白H4的乙酰化水平。结果体内实验结果表明VPA可以使DN大鼠模型血肌酐降低，24小时尿蛋白明显减少，但对大鼠模型的血糖、体重、肾重/体重的比值无影响。光镜下观察显示，，DN大鼠模型肾小球体积变大，肾小球囊腔间隙缩小，肾小球基底膜不规则增厚，系膜基质增多，部分肾小管上皮细胞出现萎缩，VPA给药后以使上述形态改变不同程度减轻。透射电镜下观察肾脏超微结构显示，DN大鼠模型的肾小球基底膜明显不规则增厚，滤过膜三层结构不清晰，足突齿梳状紊乱，间隙增宽，内皮细胞呈“拱状”增生，系膜基质增多，可见大的吞噬泡。VPA给药后上述超微结构改变不同程度减轻。VPA可以增加DN大鼠模型GRP78、减少CHOP及Caspase12蛋白的表达,且主要发生在肾小管上皮细胞处；VPA可以减轻DN大鼠模型的细胞凋亡率，细胞凋亡也主要发生在肾小管上皮细胞处。VPA可以减少凋亡相关蛋白P-JNK, ATF4、Bax, cleaved-caspase3的蛋白表达，增加Bcl-2的蛋白表达，Bcl-2/Bax的比值升高。体外实验结果表明VPA可以增加高糖诱导NRK-52E细胞ERS相关蛋白GRP78的表达，降低CHOP及Caspase12的蛋白表达；减少NRK-52E细胞的细胞凋亡率，减少凋亡相关蛋白P-JNK、ATF4、Bax、cleaved-Caspase3的蛋白表达，增加Bcl-2的蛋白表达。VPA可以使高糖诱导NRK-52E细胞及DN大鼠模型组蛋白H4总乙酰化水平明显增高，并可以使NRK-52E细胞及DN大鼠模型中GRP78基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平增高，CHOP基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平减低。结论： 1、大鼠注射STZ7天，血糖增加。22周后大鼠的24h蛋白尿、血肌酐明显增加。肾小球体积增大、基底膜不规则增厚、肾小管细胞发生明显的细胞凋亡等肾脏组织病理改变，提示发生了糖尿病肾损伤。 2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA改变了ERS相关蛋白的表达，减轻了ERS，抑制细胞凋亡，表明了VPA可以减轻DN大鼠模型的肾损伤。 3、体外实验进一步证实VPA可以减轻高糖诱导NRK-52E细胞的ERS，并减少其细胞凋亡。 4、体内外实验表明VPA对ERS的调控可能是通过调控ERS相关蛋白GRP78及CHOP基因启动子区组蛋白乙酰化水平实现的。因此，以组蛋白去乙酰化酶为靶点的去乙酰化酶抑制剂可能为DN的治疗提供一个新的选择。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R692.9

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