齐墩果酸在人前列腺癌细胞中的抗癌疗效及其作用机制

发布时间：2018-02-23 20:39

  本文关键词： 前列腺癌(PCa) PC-3细胞 DU145细胞 LNCaP细胞 齐墩果酸(OA) 抗癌疗效 细胞存活 细胞增殖 细胞迁移侵袭 前列腺癌(PCa) PC-3细胞 DU145细胞 齐墩果酸(OA) 细胞存活 细胞增殖 PI3K/Akt通路 前列腺癌(PCa) PC-3细胞 齐墩　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分齐墩果酸在人前列腺癌细胞中的体外抗癌疗效目的：探讨齐墩果酸(OA)对人前列腺癌(PCa)细胞的体外抗癌疗效。方法：用不同浓度的OA处理人PCa PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞。采用CCK-8法检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的存活能力与增殖能力的影响。采用平板克隆形成实验检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的克隆形成能力的影响。采用流式细胞术检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的凋亡与周期分布的影响。采用Transwell法检测OA对PC-3、DU145细胞和LNCaP细胞的迁移侵袭能力的影响。采用caspase活性检测试剂盒检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中caspase-、caspase-9和caspase-3活性的影响。采用线粒体膜电位检测试剂盒检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的线粒体膜电位丢失的影响。采用western blotting法检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中裂解的PARP、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、CDK4、cyclin D1、细胞色素c、PI3K、Akt、p-AktSe4473、 p-BadSer136、p-GSK-3β5er9、FOX01和p-FOXO1的蛋白表达的影响。结果：CCK-8法结果显示,OA明显抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的存活能力与增殖能力,且具有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞术结果显示,OA明显诱导了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的凋亡及G0/G1期阻滞,且具有剂量依赖性。平板克隆形成实验结果显示,OA明显抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的克隆形成能力,且具有剂量依赖性。Transwell实验结果显示,OA明显抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的迁移侵袭能力,且具有剂量依赖性。OA增加了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中caspase8、caspase-9和caspase-3的活性及裂解的PARP水平,且具有剂量依赖性。Western blotting结果显示,OA增加了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中促凋亡蛋白Bax表达,降低了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL以及CDK4和cyclin D1的蛋白表达,且具有剂量依赖性。OA促进了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞线粒体膜电位丢失以及线粒体cyt c向胞质的释放,且具有剂量依赖性。Western blotting法结果显示,OA剂量依赖性地抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中P13K、p=AktSer473、p-BadSer136和p-GSK-3pSe9的蛋白表达水平,而并未改变FOXO1和p=FOXO1的蛋白表达水平。结论：OA能够剂量依赖性地抑制人PCa细胞的体外存活能力、增殖能力及迁移侵袭能力：OA能够活化线粒体通路,抑制周期相关蛋白表达和PI3K/Akt通路活性。第二部分齐墩果酸通过PI3K/Akt通路抑制人前列腺癌细胞的体外存活与增殖目的：探讨齐墩果酸(OA)抑制人前列腺癌细胞的体外存活与增殖能力的作用机制。方法：采用质粒转染法在人前列腺癌PC-3细胞和DU145细胞中上调Akt基因的表达。采用qRT-PCR法和western blotting法验证Akt基因转染效率。采用CCK-8法检测上调Akt基因表达对OA抑制PC-3细胞和DU145细胞的存活能力与增殖能力的影响。采用平板克隆形成实验检测上调Akt基因表达对OA抑制PC-3细胞和DU145细胞的克隆形成能力的影响。采用流式细胞术检测上调Akt基因表达对OA增强PC-3细胞和DU145细胞的凋亡与周期阻滞的影响。采用caspase活性检测试剂盒检测上调Akt基因表达对OA增加PC-3细胞和DU145细胞的caspase-9和caspase-3活性的影响。采用线粒体膜电位检测试剂盒检测上调Akt基因表达对OA增加PC-3细胞和DU145细胞的线粒体膜电位丢失的影响。采用western blotting法检测上调Akt基因表达对OA抑制PC-3细胞和DU145细胞的p-AktSer473、p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达的影响。结果：qRT-PCR法和western blotting法结果显示,采用质粒转染法成功上调PC-3细胞和DU145细胞的Akt基因表达,且Akt蛋白活性也明显增加。CCK-8法结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的存活能力的抑制效应。流式细胞术结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的凋亡的促进效应。CCK-8法结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的增殖能力的抑制效应。平板克隆形成实验结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的克隆形成能力的抑制效应。流式细胞术结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的G0/G1期阻滞的促进效应。上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的caspase-9和caspase-3活性的活化效应。上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的线粒体膜电位丢失的促进效应。Western blotting法结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的p-BadSer136、Bcl-2、 p-GSK-3βSer9和cyclin D1蛋白表达的抑制效应。结论：OA通过PI3K/Akt通路来抑制人前列腺癌细胞的体外存活能力与增殖能力。第三部分齐墩果酸通过PI3K/Akt通路抑制人前列腺癌PC-3细胞的体内成瘤目的：探讨齐墩果酸(OA)抑制人前列腺癌PC-3细胞体内成瘤的作用机制。方法：四周龄大BALB/c雄裸鼠随机分为四组：NC组、NC+OA组、Akt组和Akt+OA组,每组5只裸鼠。3×106个有或无Akt质粒转染的PC-3细胞注射于相应组的每只裸鼠的右前腋窝皮下。每天150mg/kg的OA注射于相应组的裸鼠腹腔。从第六天,每3天测量肿瘤大小,第21天,处死裸鼠,分离肿瘤并称重。qRT-PCR法检测PC-3细胞成瘤组织中Akt基因的转录水平。Western blotting法检测PC-3细胞成瘤组织中Akt蛋白的表达水平。免疫组织化学法检测PC-3细胞成瘤组织中Akt、p-AktSer473、Ki-67、 p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βS349和cyclin D1的蛋白表达水平。结果：NC+OA组的PC-3细胞体内成瘤组织生长慢于NC组,NC+OA组分离的肿瘤的重量小于NC组,说明OA可以抑制PC-3细胞的体内成瘤能力。Akt+OA组的Akt质粒转染的PC-3细胞体内成瘤组织生长快于NC+OA组,Akt+OA组于第21天分离的肿瘤的重量大于NC+OA组,说明上调Akt基因表达逆转了OA对PC-3细胞体内成瘤的抑制效应。qRT-PCR和Western blotting结果显示,Akt组和Akt+OA组肿瘤组织的Akt蛋白表达高于NC组和NC+OA组,表明Akt蛋白表达成功上调。免疫组织化学法结果显示,与NC组的肿瘤组织比较,NC+OA组肿瘤组织的Ki-67、p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达受到抑制：与NC+OA组的肿瘤组织比较,Akt+OA组的肿瘤组织的Ki-67、p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达增强,说明上调Akt基因表达逆转了OA对PC-3细胞成瘤组织中的Ki-67、p-BadSer136、Bcl-2、 p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达的抑制效应。结论：OA能够通过PI3K/Akt通路抑制人前列腺癌PC-3细胞的体内成瘤能力。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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本文编号：1527536