SIRT3在高血压小鼠肾脏损害中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-23 22:02

本文关键词： SIRT3 高血压肾脏足细胞 SIRT3 KLF15 和厚朴酚高血压肾脏损害足细胞　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:高血压是慢性肾脏病的主要原因之一。高血压肾损害,主要表现为蛋白尿、进展的肾脏纤维化和炎症,是高血压的主要并发症之一。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是高血压肾脏损害的一个主要调节因素,并且在慢性肾脏病的发展进程中发挥重要作用。蛋白尿是高血压肾脏损害的一个独立危险因素,并且可以加重肾脏纤维化。大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的产生和累积导致了肾脏纤维化,从而造成了肾脏实质结构的破坏和肾脏功能的损害。肾脏纤维化的程度与高血压肾脏病的预后息息相关。足细胞,是一种终末分化的肾小球脏层上皮细胞,位于肾小球滤过膜的最外层。足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分,其结构也是比较复杂的。由胞体以及向外伸展并相互交错的足突组成,在阻止蛋白尿的产生及维持肾小球滤过屏障完整性上发挥了重要的作用。除此之外,足细胞的损伤可以引起促纤维化因子的累积,从而导致肾脏纤维化和慢性肾脏病。纤连蛋白及Ⅳ型胶原是重要的纤维化因子,它们的减少可直接抑制甚至扭转高血压引起的肾脏损害。SIRT3是NAD+依赖的去乙酰化酶家族成员之一,位于细胞内的线粒体基质,作为一个关键的调节因子参与了许多生物过程。SIRT3可以在翻译后修饰过程中,通过调节底物的去乙酰化状态而参与许多慢性疾病。近年来研究表明,SIRT3可以直接去乙酰化GSK3β,从而抑制TGFβ1信号通路,改善与老化相关的组织纤维化。在肾脏中,已有报道表明,顺铂引起的急性肾脏损伤模型中,SIRT3起到了重要的保护作用。除此之外,在肾小管上皮细胞中,AngⅡ可以减少SIRT3 mRNA的表达水平,这种作用可以被AngⅡ受体拮抗剂所阻断。在肾脏足细胞中,尼可地尔可以增加SIRT3的表达。虽然SIRT3已被报道在许多疾病的发生发展过程中发挥着不可或缺的作用,但是SIRT3对高血压引起的肾脏损害以及足细胞损伤的作用仍不清楚。研究目的:1.探讨SIRT3在高血压小鼠肾脏皮质中的表达变化;2.探讨SIRT3是否参与调节高血压小鼠的肾脏损害过程;3.探讨SIRT3对高血压引起的足细胞损伤的影响。研究方法:1.实验动物及分组:SIRT3-KO小鼠购自美国Jackson实验室,基因背景为129S6/SvEvTac。8周龄雄性129野生型小鼠购自北京大学动物研究所。SIRT3过表达小鼠通过对129野生型小鼠进行尾静脉注射SIRT3过表达慢病毒而获得。所有动物实验均符合国家卫生部动物管理办法(documentation No 55,2001)和山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。将实验动物90只随机分为六组:正常对照组;AngⅡ组;SIRT3-/-+生理盐水组;SIRT3-/-+AngⅡ组;SIRT3过表达+生理盐水组;SIRT3过表达+AngⅡ组。2.构建小鼠高血压模型:将预先灌满适当剂量血管紧张素Ⅱ的微量渗透泵分别埋入野生型小鼠、SIRT3-KO小鼠、SIRT3过表达小鼠皮下,持续泵入AngⅡ 42天,泵速为2000ng/Kg/min,造成高血压小鼠模型,对照组泵入相同剂量的无菌生理盐水。实验结束时,取材小鼠肾脏皮质进行研究。分别于实验前和实验结束时测量小鼠血压,留取小鼠尿液及血液进行相关肾脏功能指标检测。3.肾脏功能检测:将留取的血液及尿液离心后,取上清,分别用Elisa方法检测尿蛋白及肌酐水平,血肌酐及尿素氮等肾脏功能指标。4.组织免疫染色:取材后,组织切片分别进行过碘酸-雪夫(periodic acid schiff,PAS)染色,观察肾小球硬化情况;Masson染色,观察肾脏间质纤维化情况;免疫组织化学染色观察纤维化相关分子的表达情况,并采用自动图像分析软件(Image Pro Plus 6.0)进行定量分析。5.透射电镜观察肾脏超微结构:肾脏取皮质,用2.5%的戊二醛固定后,利用透射电子显微镜(TEM,H-7000FA,Hitachi,Tokyo,Japan)观察肾小球足突。6.细胞培养及处理:体外培养小鼠永生化足细胞系(MPC-5)。于5%CO2、33°C培养箱增殖,5%C02、37°培养箱分化。分化成熟的足细胞进行鉴定后,用于后续实验,进行SIRT3小干扰RNA转染等处理,给予体外培养的足细胞AngⅡ(10-6M)刺激 48h。7.蛋白质免疫印迹分析:肾脏皮质组织或细胞用裂解液裂解后,提取总蛋白。SDS-PAGE电泳后将蛋白转移到PVDF膜,封闭后孵育特异性一抗4°摇床过夜,第二天孵育二抗后,滴加ECL化学发光液,利用化学发光仪显影目的蛋白,并用Image J软件进行灰度值分析。8.免疫荧光染色:细胞用4%多聚甲醛固定,TritonX-100打孔后,封闭30分钟,滴加相应浓度的一抗,4℃孵育过夜。PBS清洗一抗后,孵育FITC或TRITC标记的二抗,经DAPI染核后,封片拍摄。9.统计学分析:定量数据以均数加减标准误表示。所有统计学分析均采用GraphPad Prism 6软件进行。两组间采用独立样本t检验,多组间采用One-way ANOVA检验。P0.05被认为有统计学意义。研究结果:1.高血压小鼠行脏皮质中SIRT3的表达水平下降Western blot结果发现,与正常对照组相比,高血压小鼠肾脏皮质的SIRT3水平明显下降。组织免疫荧光染色发现,高血压小鼠肾小球SIRT3表达明显减弱。此结果提示,SIRT3的表达水平在高血压小鼠肾脏皮质中降低。2.SIRT3调节了高血压小鼠肾脏功能我们检测肾脏功能指标发现:1.高血压小鼠与正常对照组小鼠相比,肾脏功能指标明显升高,肾脏功能受损;2.SIRT3-KO高血压小鼠比野生型高血压小鼠的肾脏功能受损更加严重;3.SIRT3过表达后,肾脏功能损害程度明显减轻。提示:SIRT3可能参与调节了高血压小鼠的肾功能。3.SIRT3参与调控高血压小鼠肾脏纤维化PAS及Masson染色显示:高血压小鼠肾脏发生了明显的肾小球硬化及间质纤维化,并且这种变化在SIRT3-KO小鼠中更为严重;SIRT3过表达后,小鼠肾脏纤维化水平得到明显改善。此外,我们检测了肾脏皮质中纤维化因子纤连蛋白及Ⅳ型胶原的表达,发现高血压小鼠肾脏皮质中的纤维化因子水平升高,特别是在SIRT3-KO小鼠中升高更为明显;SIRT3过表达后,纤维化因子的表达明显下降。这些结果提示:SIRT3可能参与了高血压小鼠肾脏纤维化的过程。4.SIRT3介导了高血压状态下肾小球足细胞损伤的调控透射电镜结果显示,高血压小鼠肾小球足突发生融合,SIRT3基因敲除后,这种融合更加严重,甚至发生断裂,并且肾小球基底膜电子密度增高。值得注意的是,SIRT3过表达高血压小鼠肾小球中,足突融合程度明显减轻,肾小球基底膜电子密度正常。结果提示:SIRT3可能参与了高血压小鼠肾小球足细胞损伤的调控。5.足细胞中,SIRT3降低了 AngⅡ引起的纤维化因子的表达研究结果发现,在体外培养的足细胞中,AngⅡ刺激引起了 SIRT3表达减少,纤连蛋白和IV型胶原的表达升高,抑制SIRT3后,AngⅡ引起的纤维化因子的表达升高更为明显。除此之外,仅在SRT3抑制后,与正常对照组相比,纤维化因子表达也增多,并且升高均有统计学意义。结果提示:在肾脏足细胞中,SIRT3可能抑制了纤连蛋白和IV型胶原的表达。结论:1.SIRT3在高血压小鼠肾脏皮质中的表达减少;2.SIRT3参与调节高血压小鼠的肾脏功能及肾脏纤维化;3.高血压小鼠肾脏足细胞的损伤与足细胞中SIRT3的表达下降有关。研究背景:慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)是全球范围的公共健康问题。高血压是导致慢性肾脏病的主要原因之一。高血压肾损害的主要病理基础是肾脏纤维化,其特征包括肾小球硬化和肾脏间质的纤维化。引起肾脏纤维化的机制非常复杂,目前尚未完全阐明。肾脏纤维化导致了肾脏功能的进一步受损以及终末期肾脏疾病的发生。至今为止,除了透析和肾脏移植外,终末期肾脏病的治疗手段还是非常缺乏并且多是无效的。因此,不断提升对高血压肾脏损害发生发展机制的认识,对慢性肾脏病的预防及治疗,发挥着极为重要的意义。SIRT3是位于线粒体的Sirtuins家族成员之一,在代谢、氧化应激等方面起到了关键的调节作用。SIRT3对疾病过程的调控,大多是通过直接调节其底物的去乙酰化状态,激活或抑制它们的活性而实现的。目前SIRT3的底物已经发现了不少。但SIRT3是如何调节高血压肾脏损害的,具体分子机制至今尚未明确。KLF15是丰富表达于肾脏和肝脏的转录因子。KLF15可以通过抑制细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的表达,减轻压力负荷引起的心脏纤维化。在5/6肾脏切除的动物模型中,KLF15改善了肾脏间质纤维化。但KLF15与SIRT3的关系,国内外尚未见报道。有研究表明,补充NAD或者使用AICAR可以增加SIRT3的表达,保护器官免受损害。以增加SIRT3的表达及活性为目的的治疗,极有可能会成为一种新的治疗手段,但目前SIRT3的激活剂报道较少。和厚朴酚是从传统中草药中分离出的一种低分子多酚类化合物,具有多种药理学活性,比如抗炎、抗氧化、抗血管生成以及抗癌。有研究表明,和厚朴酚可以通过激活SIRT3,从而抑制心肌肥厚。此外,在单侧输尿管结扎(unilateral ureterealobstruction,UUO)模型中,和厚朴酚可以减轻肾小管的损伤,并抑制肾脏间质纤维化的发生。在肾脏细胞中,和厚朴酚抑制了 TGF-β1引起的促纤维化因子的产生和ECM的累积。因此,本实验我们将探讨小鼠肾脏皮质中和厚朴酚对SIRT3的作用,以及SIRT3的激活对高血压肾损害的影响及可能的分子机制,为高血压肾脏损害的治疗提供新靶点。研究目的:1.探讨SIRT3参与调控高血压肾损害的潜在分子机制;2.探讨小鼠肾脏皮质和足细胞中和厚朴酚对SIRT3的影响;3.探讨SIRT3的激活对高血压肾损害的作用。研究方法:1.实验动物与分组:129野生型小鼠购自北京大学动物研究所。所有动物实验均符合国家卫生部动物管理办法(documentation No 55,2001)和山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。实验动物60只随机分为四组:正常对照组;AngⅡ组;SIRT3激活组;SIRT3激活+AngⅡ组。2.构建动物模型:给予129野生型小鼠腹腔注射和厚朴酚(25mg/Kg/天),构建SIRT3激活组。皮下埋置AngⅡ微量渗透泵,持续泵入AngⅡ42天,泵速为2000ng/Kg/min,造成高血压小鼠模型,对照组泵入相同剂量的生理盐水。实验结束,处以小鼠安乐死,取材小鼠肾脏皮质进行纤维化等研究。并分别于实验前和实验结束时测量小鼠血压,留取小鼠尿液及血液进行相关肾脏功能指标检测。3.肾脏功能检测:留取血液及尿液离心后取上清,分别用Elisa方法检测尿蛋白及肌酐水平,血肌酐及尿素氮水平,评估各组小鼠肾脏功能。4.组织免疫染色:取材后,组织切片分别进行过碘酸-雪夫(PAS)染色,观察肾小球硬化情况;Masson染色,观察肾脏间质纤维化;对相关纤维化相关分子进行免疫组织化学染色,并采用自动图像分析软件(Image Pro Plus)进行定量分析。5.细胞培养及处理:体外培养的小鼠永生化足细胞系(MPC-5),于5%C02、33℃培养箱增殖,5%CO2、37℃培养箱分化。分化成熟的足细胞进行SIRT3小干扰RNA转染及AngⅡ刺激,和厚朴酚干预等处理,用于后续实验。6.蛋白质免疫印迹分析:提取肾脏皮质组织或细胞蛋白,然后进行电泳。SDS-PAGE电泳后将蛋白转移到PVDF膜,封闭1h后,孵育特异性一抗4℃过夜,第二天孵育二抗,然后利用化学发光仪和ECL化学发光液显影目的蛋白条带。7.免疫沉淀反应:制备蛋白样品后,去除非特异性结合,然后利用相应的抗体,进行免疫沉淀,并用蛋白免疫印迹技术进行检测。8.免疫荧光:细胞经PBS清洗后用4%多聚甲醛固定,经Triton X-100打孔、封闭后,滴加相应稀释浓度的一抗,4℃孵育过夜。第二天清洗一抗,并孵育FITC或TRITC标记的二抗,经DAPI染核后,封片拍摄。9.统计学分析:定量数据均以均数土标准误表示。所有统计学分析均采用GraphPad Prism 6软件进行。两组间采用独立样本t检验,多组间采用One-way ANOVA检验。P0.05被认为有统计学意义。研究结果:1.SIRT3通过去乙酰化KLF15,激活了 KLF15的抗纤维化作用KLF15是肾脏富集的一个抗纤维化因子,在足细胞中我们发现SIRT3可以和KLF15共定位并相互结合,抑制SIRT3表达后,KLF15的乙酰化水平明显升高。给予足细胞AngⅡ刺激后,SIRT3与KLF15的结合能力及KLF15的去乙酰化水平均减弱。此外,抑制KLF15的表达后,我们发现纤维化因子纤连蛋白和IV型胶原升高。提示:在足细胞中,SIRT3可能通过去乙酰化KLF15而激活它的抗纤维化作用。2.和厚朴酚增加了足细胞中SIRT3的表达水平Western blot结果发现,给予足细胞和厚朴酚干预,SIRT3表达升高。而且经和厚朴酚预处理后给予AngⅡ刺激,SIRT3表达高于AngⅡ刺激组。此结果提示,在肾脏足细胞中,和厚朴酚可以增加SIRT3的表达水平。3.SIRT3-KLF15信号通路的激活,抑制了足细胞中AngⅡ引起的纤维化变化为了进一步探讨和厚朴酚对SIRT3-KLF15信号通路的影响,我们探究了足细胞中和厚朴酚干预后,KLF15的表达水平以及KLF15的去乙酰化状态,发现,给予和厚朴酚干预后,足细胞中KLF15的表达及其去乙酰化水平均增加,并且AngⅡ引起的纤连蛋白与Ⅳ型胶原的表达减少,提示:和厚朴酚可能激活了SIRT3-KLF15信号通路,抑制了 AngⅡ引起的纤维化因子的表达。4.SIRT3-KLF15信号通路的激活改善了高血压小鼠肾脏功能我们检测小鼠尿肌酐和尿白蛋白,小鼠血液肌酐和尿素氮水平。发现:给予和厚朴酚治疗后,高血压小鼠肾脏功能明显改善。提示:SIRT3-KLF15信号通路的激活可能对高血压小鼠的肾功能起到一定的保护作用。5.SIRT3-KLF15信号通路的激活减轻了高血压小鼠肾小球硬化及间质纤维化我们检测了 SIRT3-KLF15信号通路的激活对高血压小鼠肾小球硬化及间质纤维化的影响,结果显示:给予和厚朴酚治疗的高血压小鼠,肾小球硬化程度明显减轻,胶原纤维明显减少,肾脏间质纤维化得到明显改善。说明SIRT3-KLF15信号通路的激活可能抑制了高血压小鼠肾小球硬化及间质纤维化。6.SIRT3-KLF15信号通路的激活降低了高血压小鼠肾脏皮质中纤维化因子的表达我们检测肾脏皮质中相关因子的表达发现,给予和厚朴酚治疗后,肾脏皮质中SIRT3的表达升高,纤连蛋白和Ⅳ型胶原的表达明显下降。结果提示:SIRT3-KLF15信号通路的激活可能抑制了高血压小鼠肾脏皮质中纤维化因子的表达。结论:1.SIRT3激活了 KLF15的抗纤维化作用;2.SIRT3-KLF15信号通路的激活,对高血压小鼠肾脏损害发挥保护作用;3.和厚朴酚激活SIRT3-KLF15信号通路,可能作为临床治疗高血压肾损害的新靶点。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1;R692

【参考文献】