VEGF-C及其受体NRP-2对血清剥夺诱导的肾小管上皮细胞凋亡与自噬的作用研究

发布时间：2018-02-24 17:03

  本文关键词： 急性肾损伤 缺血再灌注损伤 VEGF-C NRP-2 血清剥夺 凋亡 自噬　出处：《华中科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的探讨血管内皮生长因C(VEGF-C)在肾缺血再灌注动物模型中表达的变化以及VEGF-C及其受体NRP-2对血清剥夺诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)凋亡和自噬的作用及机制。 方法(1)观察小鼠肾缺血再灌注模型中VEGF-C的表达变化：构建小鼠肾缺血再灌注模型,收集并检测各组血清总Scr, BUN的水平,PAS染色观察肾脏的病理损伤程度,免疫组织化学法及Western Blot检测VEGF-C的表达与分布。(2)观察VEGF-C及受体NRP-2对血清剥夺诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响：血清剥夺不同时间刺激NRK52E细胞,Western Blot检测血清剥夺不同时间点激活型caspase3和总caspase3的表达变化；用小分子siRNA干扰技术分别沉默VEGF-C, NRP-2的表达,利用流式细胞学方法检测VEGF-C, NRP-2沉默对血清剥夺诱导细胞凋亡率的影响,Western Blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2的表达变化；用不同浓度的重组VEGF-C因子预处理细胞,利用CCK-8法检测外源性加入VEGF-C对血清剥夺诱导的细胞活性改变的影响。(3)观察VEGF-C及受体NRP-2对血清剥夺诱导的肾小管上皮细胞自噬的影响：血清剥夺不同时间刺激NRK52E细胞,Western Blot检测血清剥夺不同时间点LC3的表达；细胞免疫荧光检测LC3表达及分布情况；透射电镜观察血清剥夺诱导后细胞的超微结构形态改变；用小分子siRNA干扰技术分别沉默VEGF-C, NRP-2的表达,Western Blot检测VEGF-C, NRP-2沉默对血清剥夺诱导LC3的表达变化的影响；在血清剥夺的条件下,加入不同浓度的巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1), CCK-8法检测细胞活性的改变；Western Blot检测加入Bafilomycin A1后VEGF-C沉默对血清剥夺诱导LC3的表达变化的影响。 结果(1)缺血再灌注损伤后,小鼠血肌酐和尿素氮上升,缺血再灌注24h时肾功能损伤最明显,而缺血再灌注48h时肾功能已经有部分恢复。与假手术组比较,缺血再灌注损伤后肾组织可见肾小管管腔扩张,伴管型形成,肾小管上皮细胞肿胀坏死及空泡变性,刷状缘坏死脱落,并且伴有炎性细胞侵润,而肾小球未见明显的病变。免疫组织化学结果显示,与假手术组比较,缺血再灌注24h组小鼠肾脏VEGF-C表达增加,并且主要表达在肾脏皮髓质交界处及髓质部的肾小管。Western blot结果显示随着缺血后再灌注时间的延长,小鼠肾组织VEGF-C蛋白的表达逐渐增加。(2)随着血清剥夺时间的延长,细胞激活型caspase3的表达增高,而总caspase3的表达减少；利用siRNA技术分别沉默NRK52E细胞VEGF-C和NRP-2的表达后,血清剥夺诱导的细胞凋亡水平均明显增加；血清剥夺刺激后,Bcl-2蛋白表达下降,而沉默VEGF-C能进一步降低Bcl-2蛋白的表达；外源性加入VEGF-C能抑制血清饥饿诱导的细胞活力下降。(3)随着血清剥夺时间的延长,LC3II蛋白的表达逐渐增加；血清剥夺诱导后LC3在胞浆点状聚集增多；透射电镜下观察到血清剥夺诱导后细胞线粒体肿胀,细胞内空泡变性显著增多,并可以见到降解自噬囊泡；分别沉默VEGF-C和NRP-2的表达后,能进一步增加血清剥夺诱导的LC3II的蛋白表达；在血清剥夺环境下,Bafilomycin A1能使细胞活力进一步降低,并呈浓度依耐性；加入Bafilomycin A1后,VEGF-C干扰组的细胞LC3表达变化的比值均低于对照siRNA组。 结论肾缺血再灌注损伤后肾脏组织中VEGF-C的表达上升,提示VEGF-C与肾缺血再灌注损伤之间存在着密切的关系；VEGF-C及其受体NRP-2能维持肾小管上皮细胞在血清剥夺环境下的存活,减少肾小管上皮细胞凋亡：VEGF-C及其受体NRP-2参与调控血清剥夺诱导的细胞自噬。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692

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