大鼠脱细胞肾脏骨架的构建及细胞相容性检测

发布时间：2018-02-27 18:35

  本文关键词： 组织工程 脱细胞肾脏骨架 细胞相容性　出处：《中国人民解放军医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：目前，，慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）的发病率逐年增加，进入CKD终末期的患者数量也在上升。透析和肾移植是目前主要的替代治疗方式，而肾移植是最有效和理想的治疗模式，但它的前提是必须有充分的器官来源，而我们国家器官短缺的问题非常突出。此外，异体移植的肾脏在宿主体内会受到免疫系统的攻击，肾脏移植患者需长期口服免疫抑制剂以避免排异反应，但药物的副作用也是众所周知的。近年来组织工程的发展使再生器官作为移植器官的来源成为可能。良好的组织工程材料是器官再生的关键，但由于肾脏结构非常复杂，目前人工合成材料无法构建如此复杂的结构。器官脱细胞的方法的出现使无细胞成分的器官骨架作为器官再生的组织工程材料成为可能。脱细胞的肾脏骨架保留了肾脏的复杂结构，而且其细胞外基质成分中有诱导细胞定植与分化的信号，这些因素都有利于肾脏再生。目前国外已有一些器官细胞洗脱方面的研究，但国内这方面的研究还很少。 目的：利用细胞洗脱的方法构建无细胞成分的肾脏骨架；对骨架的微观结构和细胞外基质成分进行检测和鉴定；检测脱细胞肾脏骨架对多种细胞的毒性；观察大鼠诱导多能干细胞在脱细胞肾脏骨架中的存活情况。 方法：（1）取出带有动静脉通路的肾脏，通过动脉向肾脏内持续依次灌注1%的十二烷基磺酸钠（sodium dodecylsulfatesodium salt，SDS）溶液和1%的Triton-X100溶液，在多个时间点观察肾脏形态和颜色的变化，并利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and Eosin stain，HE）观察是否有细胞成分残留，肾脏骨架结构是否完整；电镜观察肾脏骨架的超微结构；并用免疫组化及过碘酸 希夫氏染色（Periodic Acid-Schiff stain）的方法检测肾脏骨架细胞外基质成分的保留情况。 （2）利用浸泡过脱细胞肾脏骨架的培养基（脱细胞肾脏骨架浸提液）处理大鼠肾脏系膜细胞系、大鼠成纤维细胞系49F细胞、人肾小管上皮细胞系HK-2细胞、小鼠条件永生化足细胞系（MPC5），用MTT实验检测细胞的增殖能力，用流式细胞仪检测细胞的凋亡率和坏死率。 （3）培养大鼠的诱导多能干细胞，收集1×107数量的细胞，通过脱细胞肾脏骨架的动脉灌注到肾脏骨架中培养，观察大鼠诱导多能干细胞在骨架中的存活情况。 结果：（1）依次用1%的SDS溶液灌注12h，1%的Triton-X100溶液灌注30min后，肾脏变为白色半透明状，HE染色显示脱细胞肾脏骨架无细胞成分残留，重要的细胞外基质成分Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白、糖蛋白都得到保留，电镜显示脱细胞肾脏骨架内无明显细胞成分残留，基底膜连续完整，系膜基质也得到保留。 （2）MTT实验结果显示肾脏骨架浸提液处理过的大鼠肾脏系膜细胞、49F细胞、HK-2细胞增殖能力与对照组无明显差异；流式细胞仪检测浸提液处理后细胞的凋亡率和坏死率与对照组也无明显差异。 （3）大鼠脱细胞肾脏骨架内有iPSCs存活。结论：(1)利用1%SDS溶液和1%Triton-X100溶液能成功洗脱大鼠肾脏细胞，洗脱后的肾脏骨架内无细胞残留，结构基本完整，重要的细胞外基质成分也得到保留。（2）脱细胞肾脏骨架浸提液对大鼠肾脏系膜细胞系、49F细胞、HK-2细胞、MPC5细胞的凋亡率、坏死率及增殖能力无明显影响。（3）大鼠iPSCs可以部分在脱细胞肾脏骨架内存活。
[Abstract]:Background : At present , the incidence of chronic kidney disease ( CKD ) is increasing year by year , and the number of patients entering the end stage of CKD is also rising . dialysis and kidney transplantation are the most effective and ideal treatment modes . Objective : To construct a kidney matrix without cellular components by using the method of cell elution , to detect and identify the microscopic structure and extracellular matrix components of the skeleton , to detect the toxicity of the acellular kidney matrix to various cells , and to observe the survival of the rat induced pluripotent stem cells in the acellular kidney matrix .

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本文编号：1543874