肾脏疾病状态下金纳米粒对肾小管上皮细胞的损伤及其机制研究

发布时间：2018-03-04 23:00

本文选题：金纳米粒　切入点：阿霉素肾病　出处：《东南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：金纳米粒(gold nanoparticles, GNPs)由于制备简单、理化性质稳定、光学性质可控以及无显著毒性等优点被广泛应用于生命科学和医学领域。但是近年研究发现金纳米粒在生物医学领域的应用仍然存在着许多不确定的因素,且对机体主要排泄器官.肾脏的相关研究较少,特别是疾病状态下的毒理作用尚未见报道。显然,开展相关研究对于加快GNPs临床应用具有重要意义。慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是一组具有高患病率、高死亡率的严重威胁人类生命健康的慢性进展性疾病。肾小管损伤以及间质纤维化是慢性肾脏病肾功能减退的关键因素。值得注意的是：药物及毒物性肾损伤多累及肾小管上皮细胞；缺氧是细胞最常见的病理状态,肾脏病变时,肾小管上皮细胞常存在缺氧。基于此,我们提出本研究假说：肾脏病时肾小球滤过膜损伤,GNPs进入尿液增加,继之被肾小管上皮细胞重吸收,从而对后者造成损伤；若伴有缺氧,GNPs将加重肾小管上皮细胞损伤,并促进小管间质纤维化。为了验证上述假说,本研究应用阿霉素肾病小鼠模型和体外细胞培养的肾小管上皮细胞、巨噬细胞,借助多种手段,观察GNPs对肾小管上皮细胞的损伤作用,并探讨相关机制。方法：1.用化学还原法制备粒径分别为5nm和13nm的GNPs,并用TEM、DLS和UV—vis光谱等表征手段对其进行表征。2.通过单次鼠尾静脉注射阿霉素构建阿霉素肾病小鼠模型,以正常的BALB/C小鼠作为对照,将5nm和13nm的GNPs通过尾静脉注射至小鼠体内,采用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)、病理组织切片、透射电镜切片、TUNEL凋亡染色等方法研究纳米粒在小鼠体内的吸收、分布,并观察其对阿霉素肾病小鼠肾脏的损伤情况。3.GNPs处理缺氧培养的人肾小管上皮细胞,观察肾小管上皮细胞摄取金纳米粒、细胞的增殖活性变化,并检测细胞自噬、凋亡和氧化应激水平。4.用GNPs处理缺氧培养的巨噬细胞,收集培养上清,继之用培养上清处理肾小管上皮细胞,观察GNPs对缺氧的巨噬细胞NLRP3炎性小体激活以及产生的炎症反应对肾小管上皮细胞上皮间充质转分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的影响。结果：1.成功合成了符合要求的粒径5nm和13nm、大小均匀、分散性良好、性质稳定的金纳米颗粒,满足了后续实验要求。2.通过单次鼠尾静脉注射10mg/kg阿霉素成功建立了阿霉素肾病小鼠模型。ICP-MS检测结果显示,5nm GNPs经静脉注射至阿霉素肾病小鼠后在其肾脏内的聚集增加。组织学和透射电镜研究发现,实验组肾脏易见肾小管上皮细胞水肿(颗粒变性和空泡变性)以及蛋白管型。TUNEL染色证实5nm GNPs增加阿霉素肾病小鼠肾小管上皮细胞凋亡。3.光镜及透射电镜检查均发现,GNPs更易聚集于缺氧细胞内,并伴有自噬体和空泡形成增加。CCK-8和LDH检查结果显示,5nm GNPs在缺氧HK-2细胞内的聚集能够造成细胞生存力降低,加重细胞膜的破坏,促进细胞中LDH的漏出。Annexin V-FITC/PI双染检测显示,5nm的(GNPs(50 nM)可以有效地诱导缺氧HK-2细胞凋亡。TEM和免疫荧光的结果提示,5nm的GNPs(50 nM)可促进细胞自噬,且该作用在缺氧情况下明显增强。自噬抑制剂(3.MA)处理后发现,在常氧条件下,自噬可抑制GNPs诱导的细胞凋亡,但在缺氧时自噬可促进GNPs引起的细胞凋亡。GNPs处理后,缺氧细胞ROS水平明显增加,线粒体膜电位显著下降。4. GNPs在缺氧的巨噬细胞内的聚集也较常氧情况下明显增加,聚集的GNPs能降低缺氧细胞的增殖能力,破坏缺氧细胞的细胞膜。qRT-PCR和Western Blot的结果提示,50nM GNPs在缺氧情况下可以诱导巨噬细胞NLRP3炎性体的活化,进而诱导Caspase-1和IL-1β的释放增加,且ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine, NAC)能显著抑制GNPs诱导的缺氧细胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达,说明ROS在GNPs促进缺氧细胞NLRP3炎性体活化中起了重要作用。Western Blot和免疫荧光的结果显示,5nm的GNPs (50nM)诱导的缺氧巨噬细胞IL-18的分泌可以显著提高缺氧HK-2细胞间皮特异性标记α-SMA表达率,而降低上皮特异性标志物E-cad的表达。z-VAD-fmk可显著抑制GNPs诱导的巨噬细胞Caspase-1和IL-1β产生,同时该抑制剂还可使HK-2细胞a-SMA的表达显著降低,而E-cadherin的表达增加。这些结果共同提示5nm的GNPs(50nM)诱导的缺氧巨噬细胞IL-1β的分泌可以促进缺氧肾小管上皮细胞EMT的发生。结论：1.阿霉素肾病小鼠肾脏内5nm GNPs聚集增多,提示肾脏疾病状态下GNPs更易蓄积于肾脏,从而加剧肾脏损伤,且这一作用可能是通过促进肾小管上皮细胞水肿和凋亡而实现。2.常氧情况下,GNPs进入细胞后可诱导细胞自噬,使受损蛋白、细胞器等降解以维持细胞生存；而在缺氧情况下,进入细胞内的纳米粒增加,诱导过度自噬,促进细胞凋亡。ROS的明显增加和线粒体膜电位的显著下降可能是GNPs促进缺氧细胞凋亡的关键环节。3.缺氧情况下,GNPs在巨噬细胞内亦聚集增加,可引起细胞增殖活性下降并诱导巨噬细胞炎性体的活化,进而诱导炎症反应：而GNPs诱导的缺氧巨噬细胞IL-1β的分泌可以促进缺氧肾小管上皮细胞EMT的发生。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692

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