miR-433在膀胱癌中的抑癌作用及其分子机制研究

发布时间：2018-03-04 23:15

本文选题：膀胱癌　切入点：微小RNA　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：膀胱癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤,直接威胁着众多患者的生存健康和质量。在全世界范围内,它是男性中第七常见的肿瘤,而在女性中则排在第十七位。膀胱癌是一种进展性的移行上皮来源肿瘤。有大约三分之一的膀胱癌会发生局部浸润或远处转移。虽然膀胱癌的诊治一直在不断发展和进步,但是根治性膀胱切除术仍然是浸润性膀胱癌的治疗金标准,文献报道5年生存率只有62%。如何抑制膀胱癌的进展已经成为目前治疗研究上的关键问题,而寻找新的分子靶点、探究膀胱癌进展的分子机制则是研究热点。MicroRNA (miRNA)是一类长发约为19-22nt,具有在转录后水平调控基因表达功能的内源性非编码小RNA。它们可以直接靶向目的基因信使RNA(messenger RNA, mRNA)的3’非翻译区(3’-UTR)上的特定序列来抑制或是降解靶基因mRNA,从而下调靶基因的表达。越来越多的证据表明miRNA表达异常与膀胱癌的进展和转移有关。目的：在收集的膀胱癌组织标本以及膀胱癌细胞株中利用荧光定量PCR法检测miR-433的表达情况,探索miR-433表达下调的表观遗传学机制。采用获得性功能实验观察miR-433在膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3中的生物学功能。利用生物信息学预测和荧光素酶双报告系统寻找miR-433的直接作用靶点,并通过分析靶点基因的生物学功能,验证miR-433对于靶点的调控价值,以及下游介导的分子信号通路。方法：1)在13对配对的膀胱癌组织标本中检测miR-433的相对表达量,统计分析miR-433在膀胱癌和癌旁组织中的表达差异,并分析miR-433表达下调是否和启动子区高甲基化有关；2)通过转染miR-433模拟体(mimic)上调miR-433表达量来进行获得性功能实验。通过CCK-8、平板克隆形成、划痕实验和Transwell实验等方法来探索上调miR-433的表达对于细胞增殖和迁移侵袭能力的影响；3)在线生物信息学预测网站对miR-433的直接靶向基因进行预测,然后利用荧光定量PCR和Western Blot等证实靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化,并利用荧光素酶双报告实验对miR-433的靶向序列进行鉴定,并进一步使用RNA干扰等实验来明确靶向调控关系和下游机制。结果：1)miR-433在膀胱癌中表达下调。我们使用荧光定量PCR在13对临床膀胱癌组织标本和癌旁组织,以及三株膀胱癌细胞系T24, UM-UC-3和5637中检测了miR-433的表达水平。结果发现miR-433在肿瘤组织中的表达量相比癌旁组织显著降低。miR-433在三株膀胱癌细胞株中的表达量相比SV-HUC-1也显著降低。2)BSP结果显示在膀胱癌细胞株(T24, UM-UC-3和5637)中,miR-433启动子区处于高甲基化水平状态。5-氮杂-2'-脱氧胞苷治疗(5-氮杂胞苷)处理后miR-433的表达水平显著上升。3)获得性功能实验结果提示过表达miR-433可以抑制膀胱癌细胞的增殖和平板克隆形成。此外,上调miR-433的表达还能抑制细胞的迁移侵袭能力和上皮间质转化(EMT),其主要是通过调节AKT/GSK-3β/Snail信号来介导。4)我们利用两种方法来筛查miR-433潜在的直接靶基因：首先是生物信息学预测,然后是荧光素酶双报告实验加以证实,结果发现CREB1和c-Met是miR-433的直接靶标。5)我们使用siRNA下调CREB1或是c-Met的表达量,结果发现细胞的迁移侵袭能力和EMT进程受到抑制,其主要也是通过调节AKT/GSK-3β/Snail通路所介导的,这和miR-433在膀胱癌中的功能相一致。此外,CREB1表达量是膀胱癌患者总生存时间的一个独立预测因素。6) miR-409-3p参与了miR-433对于细胞迁移侵袭能力的抑制。c-Met可以调节miR-409-3p和miR-433的表达量。而反过来miR-409-3p和miR-433又可以直接靶向c-Met基因。miR-433/miR-409-3p和c-Met之间存在负反馈调节。miR-433可以通过靶向c-Met间接调控miR-409-3p的表达量。结论：1)膀胱癌组织中miR-433的表达量显著下调,其和启动子区的高甲基化有关。2)过表达miR-433可以抑制膀胱癌细胞的增殖、平板克隆形成、迁移侵袭和上皮间质转化。同时,miR-433可以调控AKT/GSK-3β/Snail信号通路。3) CREB1和c-Met是miR-433的直接作用靶点,它们也可以通过调节AKT/GSK-3β/Snail信号通路来抑制肿瘤进展。4)由于miR-433/miR-409-3p和c-Met之间存在负反馈调控,miR-433可以通过靶向c-Met间接调控miR-409-3p的表达量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14

【相似文献】