自噬对组蛋白介导的人肾小管上皮细胞凋亡的影响

发布时间：2018-03-08 05:38

本文选题：自噬　切入点：ROS　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是ICU常见病之一,发病率正逐年增高。研究显示肾小管细胞凋亡为其重要发病机理之一。组蛋白是真核生物染色质的主要结构蛋白,然而,有研究提出细胞外组蛋白也是一种内源性损伤相关模式分子(damage associated molecular patterns,DAMPs),其在 AKI 发病机理中有着重要作用。研究显示,通过小鼠肾动脉注射组蛋白,可以引起中性粒细胞浸润、微血管渗漏、肾脏炎症反应以及AKI病理改变。体内外实验证实细胞外组蛋白可导致肾小管上皮细胞凋亡。自噬是指膜包裹胞质蛋白或细胞器等进行降解的一种动态过程,起维持细胞稳态及更新细胞器的作用。同时,自噬也是一种应激调控机制,许多AKI模型中已证实自噬是上调的。有大量研究提出自噬可以抑制凋亡,比如在饥饿或生长因子缺乏时,自噬可以抑制凋亡保证细胞存活。研究报道,在缺血/再灌注肾损伤小鼠模型,自噬水平提高,而用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)或者氯喹预处理,肾细胞凋亡增加。目前已经明确应激情况下产生的过多反应活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)可以导致细胞凋亡。自噬是否通过减少ROS的产生从而抑制组蛋白诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡尚未清楚,本实验将针对此方面进行观测与探讨。研究目的1.明确组蛋白是否可以诱导HK-2凋亡及自噬;2.探讨自噬是否通过减少ROS产生来抑制组蛋白介导的HK-2凋亡。研究方法1.以不同浓度组蛋白刺激HK-2,分别应用流式细胞术和免疫印迹法检测HK-2凋亡情况和自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达的情况,初步了解组蛋白对HK-2凋亡和自噬的影响。2.以自噬抑制剂3-MA预处理后,分别应用流式细胞术和免疫印迹法检测组蛋白诱导的HK-2凋亡情况和caspase3活化情况,明确自噬对凋亡的作用。3.以自噬抑制剂3-MA预处理后,应用流式细胞术检测组蛋白诱导的HK-2的ROS生成量,进而明确自噬是否通过减少ROS产生从而抑制组蛋白介导的HK-2凋亡。统计学处理使用IBM SPSS 21统计软件进行分析,计量资料以X±S表示,多组间均值比较采用单因素方差分析,进一步组间均值两两比较采用LSD法或Dunnett's T3法,以P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.不同浓度组蛋白对HK-2凋亡的影响流式结果显示,不同浓度组蛋白对HK-2凋亡的影响有统计学差异(F=57.497,P0.01)。组间两两比较显示:与对照组(7.94±1.78%)比较,组蛋白 25、50、100ug/ml 组(17.31±4.41%,27.98±2.45%,53.15±7.12%)随着浓度升高而出现早期和晚期凋亡所占的比例依次升高(P0.05,P0.01,P0.01)。2.不同浓度组蛋白对HK-2 Beclin1和LC3Ⅱ表达的影响灰度分析提示不同浓度组蛋白对HK-2 Beclinl和LC3Ⅱ表达差异有统计学意义(F=4.279、4.815,P0.05)。与对照组比较,各浓度组蛋白组LC3Ⅱ、Beclin1表达水平均升高(P0.05)。3.3-MA对组蛋白诱导的HK-2凋亡的影响流式及Western blotting结果分别显示,单纯3-MA处理对HK-2凋亡率及caspase3活化水平无影响(P0.05),但显著提高了组蛋白诱导的HK-2凋亡率及caspase3 活化水平(P0.05,P0.01)。4.3-MA对组蛋白诱导的HK-2活性氧产生的影响流式结果显示,单纯3-MA处理对HK-2的ROS生成量无影响(P0.05),但显著增加组蛋白诱导的HK-2ROS生成量(P0.01)。实验结论自噬通过减少ROS产生从而保护组蛋白介导的HK-2凋亡,提示活化自噬通路在AKI中具有潜在的应用价值。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692.5

【参考文献】