双靶向融合蛋白增强肾癌腺病毒疫苗免疫活性的实验研究

发布时间：2018-03-13 17:04

  本文选题：融合蛋白　切入点：树突状细胞　出处：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：如何靶向树突状细胞(Dendritic Cells, DCs)提高免疫治疗效果是当前恶性肿瘤治疗性疫苗领域的研究热点。5型腺病毒载体疫苗在体外的实验中显示出良好的感染效率,但在体内实验中腺病毒疫苗特异性感染DCs的效率欠佳。因此,如何提高腺病毒体内特异性靶向DCs能力,增强DCs的感染效率,发挥腺病毒疫苗治疗肿瘤作用,需要进一步探讨与研究。 研究目的：利用分子生物学方法,制备一种能够对腺病毒和DCs进行双靶向的蛋白分子；使双靶向融合蛋白一方面可以与腺病毒纤维头节结合,另一方面可以与DCs表面分子DEC205结合,从而可以介导腺病毒疫苗靶向感染DCs,增强疫苗免疫效应。 方法： 1.双靶向融合蛋白的制备及活性鉴定：将5型腺病毒受体CAR的胞外段、噬菌体T4纤链蛋白以及抗小鼠DEC205单链抗体的基因序列拼接在一起,并进行原核表达密码子优化；接着将优化后的序列克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-CFmDEC,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达可溶性重组蛋白；然后采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白并利用PreScission Protease切割GST标签,获得双靶向融合蛋白(CFmDEC)。纯化后的双靶向融合蛋白经Western blot鉴定其特异性,并用ELISA、流式细胞术和免疫荧光等方法验证其生物学活性。 2.肾癌腺病毒疫苗的构建及体外功能验证：将复合基因片段sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1(tG250FcGB)克隆至穿梭载体pDC316中,构建穿梭质粒pDC316-tG250FcGB;利用AdMax腺病毒制备方法,将pDC316-tG250FcGB和腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre在HEK293细胞内重组,构建可以表达G250融合抗原的腺病毒肾癌疫苗Ad5-tG250FcGB;然后,通过Western blot检测分析Ad5-tG250FcGB在真核细胞中的表达情况。 3.CFmDEC协同Ad5-tG250FcGB抑瘤活性研究：最后,将腺病毒肾癌疫苗Ad5-tG250FcGB和CFmDEC在体外结合后免疫小鼠。观察CFmDEC和Ad5-tG250FcGB联合免疫方式对小鼠肾细胞癌的抑制作用；同时利用ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体滴度和脾淋巴细胞分泌细胞因子的改变；采用LDH法体外检测免疫小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应；以及用Elispot法检测免疫小鼠脾淋巴细胞特异性的IFN-γ的分泌。 结果： 1.成功制备了双靶向融合蛋白：通过双酶切及测序鉴定成功构建了pGEX-CFmDEC原核表达质粒,Western blot检测证实了pGEX-CFmDEC在大肠杆菌BL21(DE3)中正确表达了双靶向融合蛋白CFmDEC; ELISA分析证明双靶向融合蛋白在体外可以与其相应的受体分子有效结合；流式细胞术和免疫荧光分析证实CFmDEC可以在体外增强腺病毒对DCs的感染能力。 2.成功构建肾癌腺病毒疫苗：通过双酶切及测序鉴定成功构建了穿梭质粒pDC316-tG250FcGB；病毒基因组PCR及测序结果证实成功构建了肾癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB; Ad5-tG250FcGB转染293细胞后,通过Western blot检测分析证实腺病毒疫苗中的目的抗原基因能够有效表达。 3. CFmDEC增强Ad5-tG250FcGB的免疫效应：Ad5-tG250FcGB和CFmDEC联合免疫小鼠后,与对照组相比显著抑制了肿瘤的生长,小鼠生存时间延长了7.2天；与单独Ad5-tG250FcGB组比较,联合疫苗组脾淋巴细胞分泌出更高水平的IFN-γ (412pg/mL)和IL-2(89.3pg/mL),联合疫苗组的血清抗体IgG1/IgG2a比值与单独疫苗组相比降低0.156,同时与单独疫苗组相比对肿瘤细胞的杀伤效率增加了13%。 结论：双靶向融合蛋白CFmDEC可以在体外有效结合腺病毒载体,提高腺病毒疫苗靶向DCs的能力,在小鼠体内能够诱导更强的特异性抗肿瘤免疫反应,抑制肾细胞癌的生长。本研究为腺病毒载体靶向DCs的免疫基因治疗提供了有益的借鉴。
[Abstract]:Background: targeting dendritic cells (Dendritic Cells DCs) to improve the effect of immunotherapy is a research hotspot of.5 adenovirus vector vaccine in the treatment of malignant tumor of the field of vaccine showed good efficiency of infection experiments in vitro, but in vivo adenovirus virus vaccine efficiency specific infection DCs so poor. And how to improve the in vivo adenovirus targeting DCs ability, enhance the infection efficiency of DCs adenovirus vaccine for tumor therapy, play a role, need to be further discussed and studied.
Objective: using the method of molecular biology, a preparation of adenovirus and DCs dual targeting protein molecules; the dual targeting fusion protein can combine with adenovirus fiber scolex, on the other hand can be combined with DCs surface molecule DEC205, which can be mediated by adenovirus vaccine targeting DCs infection and enhance the immune effect of vaccine.
Method锛，

本文编号：1607305