长链非编码RNA在肾癌靶向治疗耐药中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-13 17:37

本文选题：肾癌　切入点：舒尼替尼　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究背景和目的近年来,在世界范围内肾细胞癌(RCC)的发生率逐年上升。约20%的肾癌患者在疾病诊断时已经发生肿瘤的进展转移,而且近30%的局限性肾癌患者在肿瘤切除后会发生复发转移。随着对肾癌发病机制的深入探索,受体酪氨酸激酶抑制剂被作为进展性肾癌患者的一线治疗方案。舒尼替尼(Sunitinib,Sutent?)是一种口服、多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂,可以抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞生长因子受体(KIT)等多种受体酪氨酸激酶的活性,因此,舒尼替尼具有抑制肿瘤血管和杀伤肿瘤细胞的双重作用。但是约10-20%的进展性肾癌患者在初次治疗时就对舒尼替尼先天耐药,而其余的患者往往在接受舒尼替尼治疗6-15个月后出现耐药和疾病进展,这些现状使得舒尼替尼并不能有效延长肾癌患者的生存期。许多研究提出信号转导旁路的活化可能是肾癌舒尼替尼耐药的潜在原因,然而其生物学机制尚待阐明。另一方面,目前尚缺乏预测舒尼替尼治疗疗效的生物学标志物。因此,探索肾癌舒尼替尼耐药的生物学机制以及寻找预测舒尼替尼治疗疗效的生物学标志物十分迫切。近几年,随着二代测序技术的广泛应用,原本认为是基因组转录噪音‖的长链非编码RNA(lnc RNA)被证明具有重要的生物学作用。lnc RNA是一类长度大于200个碱基的转录本,其不编码蛋白或者仅编码很短的多肽。研究表明lnc RNA可在多水平调节基因表达,包括参与染色质印记,与表观修饰复合物或转录因子结合发挥转录水平的调控,与mi RNA、m RNA或蛋白质结合发挥转录后水平的调控等。越来越多的证据表明lnc RNA参与调节肿瘤的多种生物学特性,包括增殖、凋亡、转移、代谢等,然而lnc RNA在肿瘤耐药尤其是舒尼替尼耐药中的作用尚未见报道。因此,本课题的研究目的是探讨lnc RNA在肾癌舒尼替尼耐药中的生物学作用及分子机制,为舒尼替尼抵抗的肾癌患者提供新的联合治疗靶点,并且寻找可预测肾癌舒尼替尼治疗反应性的组织学和血清学标志物,为肾癌的个性化治疗提供重要参考。二、研究方法1.利用裸鼠皮下荷瘤模型和体内连续传代方法构建舒尼替尼耐药的肾癌细胞系。2.利用lnc RNA表达谱芯片筛选舒尼替尼耐药的肾癌细胞系和亲本细胞系中差异表达的lnc RNA。3.利用肾癌临床样本以及患者移植瘤样本对lnc RNA表达水平进行筛选。4.利用RNAi方法从上述lnc RNA中筛选出对耐药细胞具有增敏作用的lnc RNA进行后续研究。5.利用5‘RACE和3‘RACE技术克隆lnc ARSR转录本的全长,并利用生物信息学(Phylo CSF、ORF-finder、CPAT)分析lnc ARSR的非编码特性。6.根据5‘RACE结果,利用生物信息学方法预测lnc ARSR的启动子区可能结合的转录因子FOXO,利用Ch IP-q PCR验证FOXO对lnc ARSR启动子区的结合。7.利用Ambion公司的mir Vana?PARIS?试剂盒抽取肾癌患者血浆中的RNA,利用Realtime PCR和PCR产物测序确定血浆中lnc ARSR的存在。8.利用肾癌患者接受舒尼替尼治疗前及治疗过程中的血样,分析血浆中lnc ARSR水平与肾癌患者舒尼替尼反应性和无进展生存期的相关性,多因素分析评判lnc ARSR作为患者预后判定的独立风险因素的可能性。9.利用肾癌患者接受舒尼替尼治疗前的肿瘤组织样本,通过RNA原位杂交检测组织中lnc ARSR表达水平,分析组织中lnc ARSR水平与肾癌患者舒尼替尼反应性和无进展生存期的相关性,多因素分析评判lnc ARSR作为患者预后判定的独立风险因素的可能性。10.利用超高速离心的方法抽提细胞培养上清中的外泌体,检测不同细胞来源的外泌体中lnc ARSR的表达量。11.利用RNA pull-down、RIP实验,研究lnc ARSR进入外泌体的机制。12.通过共培养、外泌体孵育、外泌体瘤内注射等研究外泌体传播舒尼替尼耐药的作用。13.利用慢病毒介导的lnc ARSR过表达肾癌细胞系,研究lnc ARSR对肾癌敏感细胞的舒尼替尼反应性的影响。14.利用慢病毒介导的sh RNA敲低肾癌耐药细胞系中lnc ARSR的表达,研究lnc ARSR对耐药细胞的舒尼替尼敏感性的影响。15.利用Western blot筛选表达受lnc ARSR调控的受体酪氨酸激酶,并在临床样本中进一步验证。16.利用Rescue方法,证明AXL与c-MET介导了lnc ARSR促进舒尼替尼耐药性的作用。17.利用生物信息学预测lnc ARSR与AXL/c-MET共有的mi R-34/449结合序列,通过MS2-RIP实验、报告基因以及Western blot研究lnc ARSR对mi RNA-34/449的竞争性结合作用。18.利用裸鼠肾原位和皮下荷瘤模型,研究特异性靶向lnc ARSR的锁核酸(LNA)或AXL/c-MET抑制剂对肾癌耐药移植瘤的舒尼替尼反应性的作用。三、研究结果1.肾癌舒尼替尼耐药细胞与敏感细胞的lnc RNA表达谱存在显著差异。2.通过肾癌临床样本、患者移植瘤样本及RNAi功能实验筛选出一条在肾癌耐药细胞高表达且有功能的lnc RNA,命名为lnc ARSR(lnc RNA Activated in RCC with Sunitinib Resistance)。3.与治疗前肾癌组织相比,舒尼替尼治疗后耐药复发的组织中lnc ARSR表达升高。4.转录因子FOXO1和FOXO3a通过招募组蛋白去乙酰化酶抑制lnc ARSR的转录。5.肾癌患者血浆中可检测到lnc ARSR,且舒尼替尼耐药患者的血浆中lnc ARSR水平更高。6.接受舒尼替尼治疗后肾癌患者血浆中lnc ARSR高表达组患者的无进展生存期低于lnc ARSR低表达组,且血浆lnc ARSR可作为患者预后的独立风险因素。7.肿瘤组织中lnc ARSR低表达组患者对舒尼替尼治疗敏感,而lnc ARSR高表达组患者对舒尼替尼治疗不敏感。并且在lnc ARSR低表达组,舒尼替尼治疗与患者的更好预后具有相关性。8.hn RNPA2B1参与调控lnc ARSR进入外泌体。9.耐药细胞通过外泌体介导lnc ARSR在细胞间的传递,促进舒尼替尼耐药表型的播散。10.过表达lnc ARSR可提高肾癌敏感细胞对舒尼替尼的耐药性。11.敲低lnc ARSR表达可恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性。12.lnc ARSR通过促进AXL与c-MET的表达促进肾癌细胞舒尼替尼耐药。13.lnc ARSR作为ce RNA竞争性结合mi RNA-34/449家族,拮抗mi RNA-34/449对AXL和c-MET的抑制作用,促进AXL和c-MET的表达。14.特异性靶向lnc ARSR的锁核酸或AXL/c-MET抑制剂可以增加耐药移植瘤对舒尼替尼的敏感性。四、结论本研究通过lnc RNA表达谱芯片、临床样本和功能实验筛选出一条在肾癌舒尼替尼耐药细胞中高表达且有功能的新的lnc RNA,命名为lnc ARSR。lnc ARSR可通过外泌体从耐药细胞传递至周围细胞,促进耐药表型的播散。临床研究表明肿瘤组织和血浆中lnc ARSR高表达的肾癌患者对舒尼替尼治疗反应性差。机制研究表明,lnc ARSR作为ce RNA竞争性结合mi RNA-34和mi RNA-449家族,拮抗mi RNA-34/449对AXL和c-MET的抑制作用,促进AXL和c-MET表达及下游STAT3、AKT、ERK信号通路的活化。体内研究证明,靶向lnc ARSR或抑制AXL/c-MET能够恢复耐药移植瘤对舒尼替尼的敏感性。综上所述,lnc ARSR不仅可以作为预测舒尼替尼治疗反应性的标志物,而且可以作为肾癌舒尼替尼耐药的治疗靶点,具有良好的临床转化前景。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11

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