Klotho对缺血再灌注急性肾损伤中细胞自噬的作用及其机制研究

发布时间：2018-03-14 03:35

  本文选题：急性肾损伤　切入点：缺血再灌注　出处：《上海交通大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分缺血再灌注急性肾损伤中自噬的动态改变及与肾损伤的关系目的:体内外观察自噬与凋亡在缺血再灌注急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)中的动态改变,探讨AKI过程中自噬与凋亡的关系。方法:80只雄性BALB/c小鼠随机分为假手术组(Sham,n=40)和肾脏缺血再灌注组(ischemia/reperfusion组,I/R,n=40),采用双侧肾蒂夹闭法建立缺血再灌注模型,于再灌注后0h、2h、5h、12h、1d、2d、3d和7d收集小鼠的血液及肾组织;体外培养肾小管细胞(TCMK-1)随机分为常氧组(Normoxic,Nor组)、低氧组(Hypoxia,H6h,H12h,H24h组)和低氧/复氧组(Hypoxia/Reoxygenation,H/R2h,H/R4h,H/R8h,H/R24h组),检测小鼠肾功能;HE染色观察肾组织损伤情况;Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡率;CCK-8方法检测细胞活性;Western blotting检测肾组织和细胞自噬相关蛋白LC3、p62及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达情况,电镜观察肾组织和细胞的自噬体结构。结果:1、体内实验:与Sham组相比,I/R 2h肾组织自噬表达开始升高(p0.05),表现为LC3-II/LC3-I的比值增高及p62蛋白表达的下降;第2d自噬水平最高(p0.001),至第3d自噬开始下降但仍高于Sham组(p0.05),第7d自噬降至正常水平,电镜下缺血再灌注第1d肾组织内出现吞噬了损伤线粒体和胞浆成分的自噬体结构;相比而言I/R后肾组织凋亡出现较晚,在I/R 12h时肾组织Bcl-2/Bax比值开始下降,明显低于Sham组(p0.01),第1d时凋亡最明显(p0.001),随再灌注时间的延长肾组织凋亡逐渐减轻,至第3d Bcl-2/Bax比值已恢复至正常;血Scr和BUN分别在再灌注2h和5h开始上升,至第1d达峰值(Scr:130.00±30.07umol/L vs 14.00±6.60 umol/L,BUN:45.57±8.67 mmol/L vs8.18±2.17 mmol/L;p值均0.001),随后开始降低,分别在术后第7d和第2d恢复正常;HE染色显示再灌注第1d近端小管上皮细胞出现了相应的组织学损伤表现,至第7d肾组织损伤明显减轻;2、体外实验肾小管细胞低氧刺激12h后肾小管细胞自噬开始上调(p0.05),延长低氧至24h自噬进一步升高(p0.001),细胞复氧4h、8h自噬水平开始下降但仍高于常氧组(p0.05),电镜下复氧4h肾小管细胞内大量自噬体吞噬胞浆成分,复氧24h自噬降至正常水平;而细胞低氧刺激24h凋亡才开始出现,且复氧4h、8h后Bcl-2/Bax比值较单纯低氧24h组下降更明显(p0.05),至复氧24h仍未恢复正常(p0.001);流式细胞术和CCK-8检测也发现低氧刺激24h后细胞凋亡开始增多,细胞活性开始下降(p0.05),复氧4h、8h凋亡细胞进一步增加,细胞活性也进一步下降,直至复氧24h细胞凋亡、活性仍未恢复正常。结论:缺血再灌注AKI损伤早期,自噬升高早于凋亡,而在AKI恢复期,自噬的下降晚于凋亡,自噬可能作为一种损伤适应性反应在AKI早期延缓凋亡的发生,在AKI恢复期促进肾组织的修复。第二部分调节自噬表达在缺血再灌注急性肾损伤中的作用及作用机制目的:观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,Rap)预处理对缺血再灌注时肾损伤的影响,探讨自噬在AKI中发挥的作用。方法:1.体内实验:40只雄性BALB/c小鼠随机分为假手术+veh组(SD1+veh,n=5)、假手术+3-MA组(SD1+3-MA,n=5)、缺血再灌注24h+veh组(ID1+veh,n=5)、缺血再灌注24h+3-MA组(ID1+3-MA,n=5);假手术+veh组(SD1+veh,n=5)、假手术+Rapamycin组(SD1+Rap,n=5)、缺血再灌注24h+veh组(ID1+veh,n=5)、缺血再灌注24h+Rapamycin组(ID1+Rap,n=5);小鼠肾缺血前2h腹腔注射3-MA或Rapamycin,于再灌注24h收集血液及肾组织,检测血Scr及BUN浓度的改变,HE染色观察小管坏死情况,Western blotting检测肾组织LC3、p62、Bcl-2、Bax、p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1蛋白的表达情况,TUNEL方法检测肾组织细胞凋亡;2.体外实验:肾小管细胞随机分为常氧+veh组(Nor+veh)、常氧+3-MA组(Nor+3-MA)、低氧/复氧+veh组(H/R+veh)、低氧/复氧+3-MA组(H/R+3-MA);常氧+veh组(Nor+veh)、常氧+Rapamycin组(Nor+Rap)、低氧/复氧+veh组(H/R+veh)、低氧/复氧+Rapamycin组(H/R+Rap);分别在细胞刺激前1h或4h加入3-MA或雷帕霉素,Western blotting检测细胞LC3、p62、Bcl-2、Bax、p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1蛋白的表达情况,TUNEL方法检测肾小管细胞凋亡。结果:1.体内实验:补充3-MA可明显抑制小鼠I/R 24h肾组织自噬水平,使其LC3-1向LC3-II转换减少,p62蛋白降解减少;3-MA促进了小鼠I/R后凋亡的增加,肾组织Bcl-2/Bax比值较ID1+veh组显著下降(p0.05);TUNEL结果也显示ID1+3-MA组较ID1+veh组的凋亡细胞数明显增多(62.67±10.97 vs 38.34±7.37,p0.05);补充3-MA使小鼠I/R损伤后的血BUN和Scr水平分别升高到ID1+veh组的1.47和1.49倍(BUN:66.78±11.13 mmol/L vs 45.57±10.39 mmol/L,p0.05;Scr:186.26±33.75 umol/L vs 125.21±27.82 umol/L,p0.05);HE染色也显示补充3-MA后肾组织损伤明显较ID1+veh组加重。相反,补充雷帕霉素可进一步上调肾组织I/R 24h诱导的自噬表达,表现为与ID1+veh组相比,ID1+Rap组肾组织LC3-II/LC3-I比值明显增高,p62蛋白表达明显下降(p0.05);雷帕霉素可促进I/R后肾组织Bcl-2/Bax比值上升,TUNEL结果也显示ID1+Rap组凋亡细胞数较ID1+veh组明显减少(19.43±4.16 vs 38.34±7.37,p0.05);另外补充雷帕霉素可显著降低小鼠I/R后血Scr和BUN浓度(Scr:75.36±24.21 umol/L vs125.21±27.83 umol/L,BUN:27.3±7.99 mmol/Lvs45.58±10.39 mmol/L,p值均0.05);HE染色显示与ID1+veh组相比,ID1+Rap组肾小管细胞的坏死、变性、管型的形成以及肾间质炎性细胞的浸润均明显减轻;Western blotting检测显示,小鼠遭受I/R损伤后p-m TOR及其下游底物p-P70S6K和p-4E-BP1蛋白表达明显低于SD1+veh组(p0.001),补充雷帕霉素后m TOR通路被抑制,使得肾组织I/R后的p-m TOR、p-P70S6K和p-4E-BP1蛋白表达较ID1+veh组进一步下降。2.体外实验:Western blotting结果显示:3-MA抑制肾小管细胞H/R诱导的自噬表达,并且明显降低了细胞复氧后Bcl-2/Bax的比值,加重细胞凋亡损伤,共聚焦显微镜也观察到3-MA使细胞复氧损伤后的TUNEL阳性细胞数明显增加;而补充雷帕霉素则更进一步激活了肾小管细胞低氧/复氧诱导的自噬水平,使肾小管细胞的凋亡也明显减轻,凋亡形态学也观察到H/R+Rap组TUNEL阳性细胞数显著减少;m TOR信号通路检测结果发现,肾小管细胞H/R损伤后m TOR活性未被抑制,p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1的蛋白表达水平与Nor+veh组相比无统计学差异,而补充雷帕霉素显著抑制了低氧/复氧刺激后肾小管细胞的m TOR活化,使细胞p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1蛋白的磷酸化水平显著低于H/R组。结论:缺血再灌注AKI诱导的自噬可能发挥肾保护作用,雷帕霉素可以上调肾I/R损伤后自噬的表达,可能与雷帕霉素抑制m TOR及其下游底物P70S6K、4E-BP1的磷酸化水平有关。第三部分Klotho蛋白对缺血再灌注急性肾损伤中自噬的作用目的:体内外观察补充外源性Klotho蛋白对缺血再灌注AKI中自噬的作用,探讨Klotho蛋白对AKI的保护机制。方法:1、体内实验:25只雄性BALB/c小鼠随机分为假手术+veh组(SD1+veh)、缺血再灌注+veh组(ID1+veh)、ID1+补充外源性可溶性Klotho蛋白组(ID1+kl)、缺血再灌注+3-MA组(ID1+3-MA)、ID1+3-MA+补充外源性可溶性Klotho蛋白组(ID1+3-MA+kl),每组5只,3-MA在术前2h经腹腔注射,Klotho蛋白分别在术后30min和2h各腹腔注射一次,于再灌注24h收集血液和肾组织进行后续检测。Western blotting检测肾组织LC3和p62蛋白的表达情况,电镜观察肾组织自噬体数量改变;检测血Scr及BUN浓度的改变,HE染色观察小管坏死情况并做病理评分;TUNEL方法检测肾组织细胞凋亡;2、体外实验:肾小管细胞随机分为Nor组、Nor+kl组、H/R组、H/R+kl组,外源性可溶性Klotho蛋白分别在低氧前4h和复氧时加入,于低氧/复氧4h收集细胞进行检测。Western blotting检测肾小管细胞LC3、p62、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况,电镜观察细胞内自噬体数量改变;流式细胞术检测细胞早期凋亡率。结果:1、体内实验:Western blotting结果显示,补充Klotho蛋白明显升高I/R 24h肾组织LC3-II/LC3-I的比值、降低p62蛋白表达,透射电镜的结果也显示给予Klotho蛋白可以明显增加肾组织内自噬体的数量,补充了3-MA使Klotho蛋白上调自噬的作用明显减弱。补充Klotho蛋白可以明显降低I/R 24h的血BUN和Scr的水平,HE染色和肾小管坏死评分也表明肾小管上皮细胞的变性、坏死、管型形成均减轻,肾组织TUNEL阳性凋亡细胞数显著减少,补充3-MA降低了Klotho蛋白的抗凋亡作用。2、体外实验:Western blotting和电镜结果均显示肾小管细胞在给予Klotho蛋白后,自噬水平及自噬体数量均较H/R组明显上升,细胞Bcl-2/Bax比值也显著升高,同样流式细胞术检测到给予Klotho蛋白可以明显降低肾小管细胞复氧4h的早期凋亡率。结论:Klotho蛋白可能可以通过上调I/R肾组织自噬水平发挥抗凋亡作用,减轻AKI肾组织损伤。第四部分Klotho蛋白对低氧/复氧损伤后肾小管上皮细胞自噬的作用机制研究目的:体外观察补充外源性Klotho蛋白或过表达Klotho蛋白在肾小管细胞低氧/复氧后对IGF-1/Akt/FOXO1通路的调节,旨在探讨Klotho蛋白在AKI中对自噬的作用机制。方法:TCMK-1随机分为常氧组(Nor)、常氧+Klotho蛋白组(Nor+Kl)、低氧/复氧组(H/R)、低氧/复氧+Klotho蛋白组(H/R+Kl);IGF-1干预及过表达Klotho蛋白实验分组:常氧+空载腺病毒感染组(Nor+Lac Z)、低氧/复氧组+空载腺病毒感染组(H/R+Lac Z)、低氧/复氧组+过表达Klotho腺病毒感染组(H/R+Ad-Kl)、低氧/复氧组+空载腺病毒感染+IGF-1组(H/R+Lac Z+IGF-1)、低氧/复氧组+过表达Klotho腺病毒感染+IGF-1组(H/R+Ad-Kl+IGF-1);Western blotting检测细胞IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化改变及LC3和p62蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞早期凋亡率;共聚焦观察FOXO1蛋白的核转位情况。结果:肾小管细胞H/R后IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化水平增高,补充外源性Klotho蛋白可明显抑制肾小管细胞H/R后p-IGF-1R、p-Akt、p-FOXO1的蛋白表达,并且促进FOXO1蛋白向胞核转位;补充IGF-1可明显激活细胞H/R后的IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化水平,而过表达Klotho蛋白可以降低IGF-1对该通路的上调;补充IGF-1促使肾小管细胞H/R损伤后细胞凋亡率增高,而过表达Klotho蛋白可以显著降低肾小管细胞H/R后的早期凋亡,并且能够减轻IGF-1所加重的细胞凋亡。结论:Klotho蛋白可能通过抑制肾小管细胞低氧/复氧后IGF-1/Akt/FOXO1通路的磷酸化及促进FOXO1蛋白的核转位上调细胞自噬水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692

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本文编号：1609422