巨噬细胞—精氨酸酶1-多胺轴对Pkd1条件敲除小鼠囊肿生长的作用及机制

发布时间：2018-03-15 07:23

  本文选题：常染色体显性多囊肾病　切入点：巨噬细胞　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一种因多囊蛋白1或2(polycystic protein,PC1/PC2)编码基因(PKD1/PKD2)突变导致的,以双侧、多发并逐渐增长的液性囊肿压迫及破坏周围正常肾组织,引起肾脏不可逆性功能丧失,最终导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的单基因遗传性疾病。ADPKD居ESRD病因的第四位。其中PKD1突变型占ADPKD的75%。炎症及免疫因素在ADPKD发生及发展中起到重要作用。作为发挥重要功能的免疫细胞,巨噬细胞与ADPKD进展关系更为密切。早期研究发现无论是ADPKD患者还是多囊肾病模型动物肾脏标本中均可见大量巨噬细胞浸润,且表现为M2型。而清除模型动物体内的巨噬细胞可以显著延缓多囊肾病的进展。体内实验则证实巨噬细胞可以通过分泌可溶性细胞因子促进囊肿衬里上皮细胞增殖,但具体是何因子尚不知晓。研究方法:通过条件性敲除小鼠体内Pkd1基因使其表现出与人类多囊肾病近似表型。研究小鼠多囊肾病发病过程中囊肿衬里上皮细胞增殖速率、囊肿指数及肾功能变化的规律。通过免疫组化染色(IHC),在多时间点进行Pkd1敲除小鼠肾组织内巨噬细胞染色及计数,明确巨噬细胞浸润数量与肾囊肿增殖速度的关系。发现并证实早期发病的Pkd1敲除小鼠肾脏增殖呈双峰变化,第二个高峰起点出生后第24天(P24),峰值点在P32。利用基因芯片比较两个时间点小鼠肾组织中mRNA表达谱,在差异性表达基因中寻找与巨噬细胞活化、极化、迁徙等有关的因子,筛选出关键因子精氨酸酶1(ARG1)。利用QPCR技术检测及比较P24和P32两个时间点的共计14个巨噬细胞极化关键因子在肾组织mRNA的变化差异,证实ARG1是差异最为显著的因子。随后通过激光共聚焦免疫荧光多重染色,比较浸润在肾组织中的巨噬细胞内极化标记分子(NOS2、ARG1、TNFα、CD206、TGFβ和IL10)在ADPKD不同发病阶段的表达差异,再次证实ARG1在巨噬细胞中呈逐步表达,在P22-24天时开始增高,而在P32天时呈极高表达,与囊肿增殖速度趋势完全重合。微观方面,在多时间点利用免疫荧光三重染色证实巨噬细胞表达ARG1强度与周围组织中Ki-67阳性细胞比例的关系。宏观方面,利用免疫荧光全片扫描技术计算在一个完整横截面下F4/80阳性及ARG1阳性细胞总数,分析不同标记阳性的细胞总数与同一截面下囊肿指数、大囊肿(直径"g1000μm)及中等大小囊肿(直径500~1000μm)数量的相关性。通过上述结果,我们将早期发病的Pkd1敲除小鼠发病阶段划分为两段,即发育相关增殖阶段(P12-P24)和巨噬细胞促增殖阶段(P24-P32)。以两个阶段为基础,利用氯磷酸二钠脂质体分三个干预时段清除小鼠体内巨噬细胞,比较不同干预期小鼠肾功能、囊肿指数、肾脏增殖率等一系列指标。利用ARG1特异性抑制剂Nor-NOHA干预小鼠体内精氨酸代谢通路,并观察是否可以延缓ADPKD的进展。最后,利用代谢组学、基因芯片及IHC等方法证明巨噬细胞通过调控自身ARG1的表达,影响精氨酸-鸟氨酸-多胺代谢通路并由此刺激囊肿快速增长,而Nor-NOHA通过干扰这一通路有效延缓了ADPKD的进展。结果:(1)早期发病的Pkd1敲除鼠肾脏经历两个增殖高峰,第一个高峰在P18,与肾脏发育有关,变化趋势与野生型近似;第二个高峰在P32,与野生型显著不同(野生型肾增殖率在第一峰下降后不再提高);(2)早期发病的Pkd1敲除鼠肾脏巨噬细胞浸润规律:P18开始出现,P24-P26显著增多,直至P32处死时肾间质中始终大量浸润;(3)ARG1是与ADPKD增殖速度最为密切的巨噬细胞相关标记分子;(4)无论在空间上还是时间上,表达ARG1的巨噬细胞与囊肿增长速度均呈显著正相关;(5)第一阶段(P12-22)清除小鼠体内巨噬细胞并不能改变多囊肾表型、囊肿增长速度和肾功能损害程度;而第二阶段(P22-32)清除巨噬细胞后可以显著改善早发型多囊肾小鼠的上述指标,且与全程(P12-P32)清除巨噬细胞的治疗效果无显著差异;(6)ARG1抑制剂Nor-NOHA对早发型Pkd1敲除鼠ADPKD进展的治疗效果不理想;(7)晚发型Pkd1敲除鼠在ADPKD发病规律上与早发型小鼠十分近似,在Pkd1敲除后(P28)的第5个月开始出现肾脏微囊,在10月龄时呈现与早发型多囊肾小鼠完全一致的ADPKD表型,且两者基因表达谱也十分近似;(8)Nor-NOHA通过影响ARG1的活性抑制精氨酸向鸟氨酸转化,并由此显著的抑制了晚发型Pkd1敲除鼠ADPKD的疾病进展;(9)巨噬细胞通过上调自身ARG1的表达,抑制NO合成,促进鸟氨酸生成,并由于ADPKD发病过程中鸟氨酸—多胺代谢通路多个酶的活化,促使多胺产生增加,最终刺激囊肿上皮细胞增殖及囊肿增长。结论:(1)ARG1阳性的巨噬细胞真正刺激囊肿衬里上皮细胞的增殖及囊肿增长;(2)巨噬细胞通过调控自身ARG1的表达,改变巨噬细胞内鸟氨酸和一氧化氮的合成量,生成大量多胺代谢底物,参与鸟氨酸-多胺代谢通路并由此刺激囊肿快速增长;(3)Nor-NOHA可以在一定程度上纠正多囊肾微环境中巨噬细胞内ARG1/NOS2失衡,影响鸟氨酸形成,通过减少多胺代谢通路的底物进而干扰整个代谢途径,有望成为另一个ADPKD有效的治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

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本文编号：1615037