细菌FimH蛋白在ANCA相关性血管炎中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-16 15:34

本文选题：抗中性粒细胞胞质抗体　切入点：血管炎　出处：《第三军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的：抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是自身免疫性系统性小血管炎(Small vesselvasculitis，SVV)，因循环中存在ANCA包括髓过氧化物酶抗体(myeloperoxidase，MPO)和蛋白酶3抗体(protease3，PR3)而命名，肾脏病理主要表现为局灶坏死性肾小球肾炎(focal necrotizing glomerulonephritis，FNGN)，伴新月体形成，病情进展凶险，通常导致快速进展的肾功能衰竭，愈后很差[1]。人溶酶体膜蛋白-2(human lysosomalmembrane proteins2,hLAMP-2)抗体是新近由Kain等[2，3]报道的一种ANCA新亚型，与肾脏损伤高度相关，其由细菌鞭毛FimH蛋白通过“分子模拟”(Molecular Mimicry，MM)机制致病，即革兰氏阴性杆菌的鞭毛蛋白第72至80位氨基酸残基多肽(FimHP72-80)与人LAMP-2第41至49位氨基酸残基多肽(LAMP-2P41-49)具有100%同源性，导致机体识别病原体FimH抗原产生的免疫应答，也直接作用于自身抗原LAMP-2蛋白，导致小血管及肾脏的坏死性病变[2]。提示细菌入侵人体后，通过FimH启动针对LAMP-2的自身免疫是ANCA相关性FNGN发病机制的关键。不同于Th1细胞与Th2细胞，Th17细胞是新型的CD4+辅助性T细胞(T helper，Th)亚群，通过分泌白介素-17(interleukin-17，IL-17)、肿瘤坏死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）等炎症因子，参与机体重要生理或病理进程。Nogueira等[4]研究发现，急性期AAV患者血清IL-17A水平显著升高，肾组织上可见IL-17大量表达，血清IL-23及MPO和PR3特异性的Th17细胞数均增高，提示IL-17在AAV的发生中起重要作用[1]。无论在ANCA阳性的血管炎患者，还是血管炎小鼠模型，均存在MPO-ANCA或PR3-ANCA特异性的Th17细胞克隆及反应[2]，提示Th17细胞可能参与了ANCA相关的病理损伤。然而，细菌感染后如何激活宿主自身免疫，具体机制需要进一步探索。含鞭毛蛋白（FimH）的细菌感染后，IL-17变化情况及其与肾脏损伤是否相关，目前还未见报道。 LAMP-2抗体的发现被认为开创了继传统ANCA的又一个新纪元，但是否能成为临床诊断AAV的血清学标志目前还存在争议[3,4,5]，其敏感性和特异性还需进一步验证。本研究拟从临床出发，通过诊断性试验研究设计，探讨LAMP-2抗体在本单中心对AAV的诊断价值；同时从发病机制出发，，构建FimH融合蛋白表达载体并纯化，联合Titermax Gold佐剂，皮下免疫WKY大鼠，初步观察大鼠肾小球损伤及血清IL-17A水平、与蛋白尿相关性等，进一步探讨感染与AAV自身免疫的可能机制。方法： 1. LAMP-2抗体在AAV中临床价值评价按改进的美国Chapel Hill血管炎会议(CHCC)诊断标准[6]，筛选2010年09月至2013年06月，就诊于第三军医大学新桥医院肾内科的AAV新月体肾炎患者32例，其中28例肾活检明确为新月体肾炎，以ANCA阴性其他肾小球肾炎42例为病例对照组；50例健康志愿者，为健康对照组。入院后收集各组血清，以健康志愿者血清光密度（optical density，OD）值加2倍标准差（standard deviation，SD）作为参考值截止值(cut off值)。以重组人LAMP-2/CD107b为包被抗原（RD公司），间接ELISA法检测血清LAMP-2抗体。参照试剂盒说明，采用欧蒙印迹法及间接免疫荧光法检测MPO、PR3及GBM等(欧蒙医学诊断股份公司)。列出诊断性实验四格表，计算诊断评价指标：敏感度(sensitivity,Sen)、特异度(specificity, Spe)、阳性预测值(positive predictive value,PPV)、阳性似然比(positivelikelihood ratio, PLR)、阴性预测值(negative predictive value, NPV)、阴性似然比(negativelikelihood ratio, NLR)及约登指数(Youden index, YI)等。 2. FimH1-156融合蛋白的制备PCR法克隆pPKL241质粒获取FimH1-156基因，插入原核表达载体pET28a(+)；将重组表达质粒转染感受态E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达FimH融合蛋白，超声裂解细菌，Ni-NTA层析法进行纯化，SDS-PAGE分析、Western印迹法对其进行鉴定。LAMP-2表位肽P41-49的合成及鉴定由杭州中肽生物有限公司合成，并经质谱鉴定，纯度大于95%。 3. FimH1-156融合蛋白及LAMP-2表位肽P41-49诱导的病理模型：融合蛋白模型组：采用纯化的大肠杆菌FimH融合蛋白(150μg)联合Titermax金佐剂(150μl)皮下注射免疫Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，融合蛋白对照组：采用PBS(150μl)+Titermax金佐剂(150μl)。多肽模型组：采用完全弗氏佐剂联合LAMP-2表位肽P41-49免疫WKY大鼠，在每只WKY大鼠尾根部皮下注射600μl鸡尾酒式乳化液：内含300μl完全弗氏佐剂以及300μl双蒸水溶解的0.3mg LAMP-2多肽P41 49。多肽对照组：大鼠采用双蒸水代替多肽免疫大鼠。监测各时间点(0、3、7、14、21、28、35、50天)大鼠24小时尿蛋白总量的变化，于免疫后21天、35天和50天检测大鼠血清尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)水平，观察肾、肺组织病理变化，ELISA法检测血清IL-17A水平。结果： 1.2010年9月至2013年6月期间，符合纳入标准的AAV新月体肾炎患者32例，其他肾小球肾炎42例。50名健康志愿者来自新桥医院健康体检中心。在32例AAV中，30例检出LAMP-2抗体阳性。而在42例疾病对照组中，7例检出阳性。其中ANCA阴性、其他自身抗体阴性的新月体肾炎检出LAMP-2抗体的4例。健康对照组无阳性抗体检出。列出诊断性实验四格表后，计算出其敏感度(Sen)、特异度(Spe)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)及约登指数(YI)，分别为93.8%、83.3%、81.1%、94.6%、5.625、0.075和0.771。 2.成功构建原核表达载体pET28a-FimH1-156，经对融合蛋白表达条件的优化，在IPTG浓度为1mmol/L诱导4h后，目的蛋白表达量最高，主要以包涵体形式存在；WB证实该FimH1-156融合蛋白可与抗6×His单克隆抗体发生反应。 3.融合蛋白模型组的大鼠24小时尿蛋白总量在免疫后第3天开始升高，第7天、35天、50天时显著高于其对照组(p0.05)；免疫后50天，大鼠血清UREA、CREA、UA水平，均显著高于其对照组(p0.05)；免疫后35天，肾脏组织显示局灶坏死，免疫后50天新月体形成，肺泡壁增厚、部分断裂；免疫WKY大鼠35天后，血清IL-17A表达均显著高于其对照组(p0.05)； IL-17A与24小时尿蛋白之间存在明确相关性(R=0.5566，p=0.0210)。多肽模型组的大鼠在13天时24小时尿蛋白定量显著高于多肽对照组(P0.05)；肾脏损伤无明显特异性，可见系膜细胞增生、炎性细胞浸润，未见明显局灶坏死及新月体形成；IL-17A水平表达也显著高于多肽对照组(P0.05)。结论： 1. LAMP-2抗体对AAV所致新月体肾炎具有较好的诊断价值，并在ANCA阴性的新月体肾炎发现LAMP-2抗体，需进一步大样本验证。 2.成功克隆FimH1-156融合蛋白表达基因并构建至原核表达载体，获得了包涵体纯化的FimH1-156融合蛋白，为下一步建立实验动物肾损伤模型奠定了基础。 3.细菌FimH融合蛋白诱导大鼠肾小球局灶坏死性损伤及肺损伤，IL-17A参与了FimH融合蛋白诱导的大鼠肺、肾损伤过程。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692.31

【参考文献】