microRNA-17-5p在急性肾损伤发病中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-19 00:25

本文选题：急性肾损伤　切入点：microRNA　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景及目的急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是临床非常常见,花费极高且造成住院病人死亡率明显增加的危重症[1],其发病率约为2‰[2]。患者的预后直接取决于AKI的严重程度,甚至是极轻微的血清肌酐水平变化也不可忽视[3]。近年研究表明发生AKI后,损伤最早出现在近端肾小管上皮细胞,并表现为各种形式的细胞死亡,而肾脏功能的恢复则依赖于那些存活下来的肾小管上皮细胞,通过去分化及增殖以重建肾单位[4,5]。因此增强肾小管上皮细胞对损伤的抵抗力,提高其存活率,即为有益于损伤后的修复进程,亦对治疗和预后有着不可小觑的意义。近年来,虽然对近端肾小管上皮细胞凋亡的定义及分类已有较为明确的结论,但损伤后诱发其凋亡的使动因素及相关机制尚不清楚,而探寻上游基因水平调控机制对于治疗甚至于预防AKI都有非凡的临床价值。MicroRNAs(miRNAs)是一类具有基因表达调控功能的非编码小分子RNA,通过转录后调控靶基因mRNA的翻译过程及其在胞质中的稳定性从而抑制靶基因表达[6-10](图1)。至少有1000个miRNAs经生物信息学分析参与人体几乎所有细胞进程的调控,其表达水平的改变与很多疾病的病理过程密切相关[11-15]。在众多miRNAs中,miRNA17簇(miRNA17 cluster,miR17~92)是研究最为广泛的一组miRNAs。miR17~92的缺失不仅发现直接影响动物肺部及心血管系统的发育,还对损伤后病理及修复过程的调控至关重要[16-20]。近期肾脏方面的研究证实miR17~92的缺陷使得小鼠肾脏细胞增殖受到抑制,肾单位数量减少,6周龄即出现蛋白尿,3月龄出现肾小球硬化[21]。同时miRNAs在AKI中的作用也逐渐成为研究者关注的焦点,美国乔治亚摄政大学(前乔治亚州医学院)首次使用Dicer(miRNA生物合成的关键酶)近端肾小管细胞特异性敲除鼠证实,在肾脏缺血再灌注损伤(Renal Ischemia Reperfusion Injury,IRI)动物模型中总体miRNAs耗竭减缓了缺血性损伤[22]。而令人振奋的是随后有研究者发现miR-17~92中最主要的mi RNA,即miR-17主链(miR-17-5p)在IRI后的修复阶段被激活[23],但并未深入研究这一活化对于肾小管上皮细胞的抗凋亡能力及肾脏的再生修复是否有利,以及其作用机制如何尚不清楚。本课题的目的是观察miR-17-5p在急性肾损伤中的作用及对近端肾小管上皮细胞凋亡的影响,并进一步探讨miR-17-5p上下游信号通路的调控作用,为AKI的治疗提供新的思路和实验依据。研究方法1、aki体内、体外模型及mir-17-5p的表达:(1)体内动物模型:8-12周龄雄性c57bl/6小鼠,随机分为假手术组(sham)、缺血再灌注损伤无修复模型组、缺血再灌注损伤伴修复模型组。缺血再灌注损伤无修复模型组小鼠给予双侧肾动脉夹闭缺血30分钟松夹再灌注手术处理,分别于急性损伤期即再灌注12小时(i30r12h)和损伤晚期即再灌注48小时(i30r48h)处死动物,留取肾皮质组织并提取组织总rna。缺血再灌注损伤伴修复模型组小鼠给予双侧肾动脉夹闭缺血25分钟松夹再灌注手术处理,分别于各个修复期即再灌注1天(i25r1d)、3天(i25r3d)、5天(i25r5d)、7天(i25r7d)处死动物,留取肾皮质组织并提取组织总rna。对标本进行real-timepcr检测并分析mir-17-5p在急性肾损伤不同阶段的表达变化。(2)体外细胞模型:培养近端肾小管上皮细胞系rptc。采用物理性缺氧模型(hypoxia)及化学性缺氧模型(叠氮化钠,sodiumazide)。hypoxia模型组,给予1%氧培养细胞,分别于0小时(0h)、6小时(6h)、12小时(12h)、24小时(24h)、36小时(36h)、48小时(48h)收集细胞提取细胞总rna。sodiumazide模型组,给予1mol/lsodiumazide培养细胞3小时后更换新鲜培养液复氧处理,分别于复氧1小时(1h)、2小时(2h)、3小时(3h)收集细胞提取细胞总rna。对标本进行real-timepcr检测并分析mir-17-5p在aki不同体外模型中的表达变化。2、mir-17-5p生物学功能体外实验:采用脂质体法转染mir-17-5p寡核苷酸抑制探针(anti-mir-17-5p-lna)或内源性mir-17-5p模拟物(mir-17-5pmimic)入rptc细胞,制备体外缺氧模型,分别采用细胞形态学分析及hoechst染色法观察细胞凋亡率,并收集细胞提取细胞蛋白,采用immunoblotting技术分析凋亡标志物caspase-3裂解。3、下游机制研究:通过生物信息数据库预测mir-17-5p下游靶基因,初步选定多个数据库一致且存在多个物种保守序列的靶基因死亡受体6(deathrceptor6,dr6)进行下一步体内、体外验证:雄性c57bl/6小鼠给予双侧肾动脉夹闭25分钟,再灌注1d,3d,5d,7d,留取肾脏皮质提取总蛋白,采用immunoblotting分析dr6变化。构建含有mir-17-5p绑定序列的dr63’utr荧光素酶表达载体,并与mir-17-5pmimic或无效序列(scrambledsequenceoligonucleotide)共转染细胞,检测荧光素酶活性变化;进一步构建dr6基因下调rptc细胞系制备缺氧模型,收集细胞提取细胞总蛋白采用immunoblotting检测dr6变化,并进行细胞形态学分析及hoechst染色法观察细胞凋亡率。4、上游机制研究:通过生物信息学分析预测mir-17-5p上游可能的调控机制,初步分析获得转录因子p53与mir-17-5p宿主基因的可能调控位点,并采用染色质免疫共沉淀法(Ch IP)证实其绑定调控关系。进一步进行体外、体内实验验证。(1)体外实验:培养RPTC细胞,给予特异性p53通路抑制剂(pifithrin-α)干预后制备缺氧模型,采用Real-time PCR分析miR-17-5p表达的变化。构建显性失活突变体p53(Dominant-negative p53,DN-P53)过表达RPTC细胞系,制备缺氧模型后Immunoblotting分析p53及DN-P53变化,Real-time PCR分析miR-17-5p表达变化。(2)体内实验:繁育并鉴定肾脏近端肾小管p53野生型(PT-P53-WT)和敲除型小鼠(PT-P53-KO),给予双侧肾动脉夹闭30分钟松夹再灌注48小时(I30R48h)处理,留取小鼠血标本测尿素氮(BUN)、血肌酐(sCr),提取肾脏皮质蛋白及RNA,immunoblotting检测p53变化,Real-time PCR分析miR-17-5p表达变化。研究结果1、miR-17-5p在急性肾损伤非修复动物模型损伤晚期表达明显上调,在急性肾损伤伴修复动物模型各个时期均有上调,体外模型中,miR-17-5p于缺氧6小时出现微弱上调,24小时上调最明显;而化学性缺氧不能诱发miR-17-5p表达上调。2、miR-17-5p表达上调可以明显抑制缺氧诱发的RPTC细胞凋亡,而外源性抑制miR-17-5p的表达则使RPTC细胞对缺氧刺激耐受下降,凋亡增加。3、小鼠肾脏缺血25分钟再灌注1天后,DR6在肾脏皮质组织中的表达即明显减少,并且持续一周。内源性miR-17-5p模拟物可以显著抑制RPTC细胞中DR6的表达,相反miR-17-5p寡核苷酸抑制探针则解除miR-17-5p对DR6的抑制作用。通过构建含miR-17-5p在DR6 3’非翻译区(3’UTR)绑定序列的荧光素酶表达载体证实DR6为miR-17-5p下游直接靶基因。而DR6基因下调的RPTC也对缺氧的耐受增强,凋亡明显减少。4、miR-17-5p两个宿主基因miR-17-1及miR-17-2启动子区均存在p53调控位点,通过染色质免疫共沉淀法证实在缺氧条件下p53通过其调控序列诱导miR-17-5p表达。P53通路抑制剂可以显著抑制p53表达,从而抑制miR-17-5p在缺氧条件下的上调。同时,过表达抑制p53基因转录调控活性的显性失活突变体RPTC细胞中,缺氧条件不能诱发miR-17-5p表达上调。P53近端肾小管上皮细胞条件性敲除的小鼠,经缺血30分钟再灌注48小时后,miR-17-5p在肾脏皮质中的表达明显减少。但小鼠肾功能并未恶化,反而有所改善。结论本课题经体内和体外实验探索发现了在急性肾损伤中大量表达且具有肾小管上皮细胞保护作用的miR-17-5p,其上调依赖于p53转录调控,并且通过抑制下游靶基因DR6实现抗凋亡等肾脏保护作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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