MicroRNA-449a增强人前列腺癌细胞辐射敏感性的机制研究

发布时间：2018-03-20 18:04

  本文选题：MicroRNA　切入点：辐射敏感性　出处：《兰州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前列腺癌是全球男性第二大常见癌症,是男性癌症死亡的第三大因素。目前,放射治疗是一种最常见的、疗效明确的局限性前列腺癌治疗方法。但前列腺癌放射治疗决不是无害的,其放射治疗的肠、尿道副作用必须予以考虑。另外,有相当多数的前列腺癌患者自首次接受放射治疗后,后期存在局部辐射耐受和复发。因此,如何提高前列腺癌细胞的辐射敏感性、降低放射治疗剂量、有效杀死肿瘤细胞、改善放射治疗的疗效仍是目前临床医生和科研工作者亟待解决的问题。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性、非编码小RNAs(约22nt),在转录后水平调节基因表达。在人类基因组中,目前已发现并鉴定出了4000多条人源miRNAs,靶向至少60%的蛋白编码基因。毫无疑问,miRNA作为重要的基因表达调控因子,影响多个信号传导通路,包括在电离辐射(Ionizing radiation,IR)诱导的DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)中发挥重要作用。近年来,越来越多的实验证据表明,miRNA参与肿瘤细胞的辐射敏感性调控,可能成为一种新型的、临床肿瘤放射治疗的致敏靶分子。为了揭示miRNA在前列腺癌细胞应答电离辐射中的表达变化及作用,阐明miRNA影响前列腺癌细胞辐射敏感性的分子机制,本论文首次采用人源miRNA芯片技术研究了不同LET的12C6+离子辐照后前列腺癌细胞中miRNA表达谱变化,筛选出电离辐射后差异表达的miRNAs。随后进一步采用荧光定量反转录PCR(q RT-PCR)进行验证。结果显示:不同LET的12C6+离子和X-射线辐照处理LNCa P细胞24h后,miRNA的表达变化并不同,包括miR-17-92簇、miR-15/16家族、miR-34家族和let-7家族。在LNCa P细胞中,X-射线和30ke V/μm 12C6+离子辐照后24h,miR-17-92簇、miR-15/16家族miRNAs显著上调,而let-7和miR-34家族miRNAs表达下调。与X-射线辐照相比,70ke V/μm的12C6+离子辐照后引起更多的miRNAs表达变化,其中miR-17-92簇、miR-15/16家族的miRNAs表达显著下调,而let-7家族和miR-34家族miRNAs表达上升。值得关注的是,X-射线和不同LET的12C6+离II子辐照后,miR-449a表达均有上调,采用生物信息学在线预测软件Target Scan预测发现c-Myc是miR-449a的一个阳性靶基因。已有文献报道,在各种人类恶性肿瘤中,包括前列腺癌,miR-449a表达下调,而c-Mcy基因过表达。我们的q RT-PCR结果也显示:与正常前列腺组织相比,miR-449a在前列腺癌组织中表达下调,而c-Myc显著过表达。在细胞应答IR中,miR-449a在LNCa P细胞中被诱导表达,而c-Myc表达被抑制。相关性分析表明,miR-449a与c-Myc表达呈负相关性。随后,我们构建了表达miR-449a的重组质粒GV214-miR-449a和表达c-Myc 3′-UTR及c-Myc 3′-UTR突变的重组质粒GV272-c-Myc 3′-UTR wt/mut。双萤光素酶报告系统实验证实,在LNCa P细胞中miR-449a直接通过与c-Myc 3′-UTR相结合靶向抑制c-Myc表达。利用GV214-miR-449a转染前列腺癌LNCa P细胞,发现miR-449a增强IR诱导的细胞生长阻滞,提高LNCa P细胞对IR的敏感性。利用RNAi技术,敲低c-Myc表达同样增强LNCa P细胞的IR敏感性。这些研究结果说明:miR-449a可以通过靶向下调c-Myc表达来增强前列腺癌细胞的辐射敏感性。但进一步的研究发现:miR-449a增强肿瘤细胞电离辐射敏感性的功能并不是广泛的。在Rb野生型的LNCa P和PC-3细胞中过表达miR-449a,降低电离辐射后的细胞活性,增强电离辐射诱导的细胞增殖抑制,最终使LNCa P和PC-3细胞对电离辐射敏感;但在Rb突变的DU-145细胞中过表达miR-449a,电离辐射后,细胞周期分布并无显著性变化,细胞凋亡率增加也不明显。通过分析前列腺癌细胞的分子生物学特征及采用WB分析发现,LNCa P、PC-3和DU-145细胞有不同的p53和Rb蛋白表达状态。一方面,LNCa P细胞表达野生型的p53、DU-145表达含有p53233leu和p53274phe两种突变的p53,而PC-3细胞不表达任何p53蛋白,表现为p53缺失;另一方面,LNCa P和PC-3细胞表达野生型Rb蛋白,而DU-145细胞在Rb基因的21号外显子缺失105bp的碱基对,表达无活性的截短体RB蛋白。因此,推测miR-449a增强前列腺癌细胞的辐射敏感性可能与RB蛋白的状态相关。进一步采用WB分析检测细胞周期和凋亡相关的信号蛋白表达发现,miR-449a/c-Myc增强前列腺癌细胞的辐射敏感性与CDC25A/RB/E2F1信号通路相关。一方面,miR-449a/c-Myc可通过抑制CDC25A/RB/E2F1信号通路及Cyclin B1/Cdc2周期相关蛋白增强电离辐射诱导的G2/M期阻滞。另一方面,miR-449a/c-Myc也可通过下调凋亡靶基因Bcl-2的表达,激活线粒体凋亡信号通路相关的蛋白表达,诱导细胞凋亡。这些研究结果为探讨前列腺癌的发生发展分子机理提供了新思路,考虑到miR-449a增强前列腺癌细胞辐射敏感性的潜能,本文的研究结果可为前列腺癌的放射治疗提供一个新靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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本文编号：1640204