miR-377-3p调控SGK3在糖尿病肾病中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-23 01:36

本文选题：miR-377-3p　切入点：糖尿病肾病　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的糖尿病(diabetesmellitus,DM)导致的高死亡率在我国仅次于心血管疾病和肿瘤。而糖尿病肾病也被公认为是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一,已经严重威胁人类健康。微小RNA(miRNA)通过对靶基因的表达调控参与多种生理和病理过程,如细胞的生长、凋亡及肿瘤发生发展等。已有研究表明miRNA同样参与糖尿病肾病的病理进程。本项研究的目的是筛选发现在糖尿病肾病中发挥明显调控作用的miRNA,以及miRNA的作用机制,进一步阐明miRNA与已知的糖尿病肾病相关信号通路之间的关系,以期为糖尿病肾病的诊疗提供新的依据。研究方法我们用miRNA芯片技术对细胞中的miRNA进行了筛选,通过分析miRNA的表达差异,结合其生物学功能选择miR-377-3p作为下一步的研究对象。q RT-PCR检测了miR-377-3p在不同浓度葡萄糖处理后HK-2细胞中的表达水平,及其在30位糖尿病肾病患者和30位体检健康者中的表达水平。同时我们构建了小鼠糖尿病肾病模型,用于之后miR-377-3p的体内功能研究。下一步,MTT法检测了miR-377-3p对HK-2细胞活性的影响,流式细胞术及western blot检测了miR-377-3p对HK-2细胞凋亡的影响。接下来的动物实验中,用Tunel和免疫组化的方法验证了miR-377-3p对肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响。为了寻找miR-377-3p下游作用的靶基因,我们用生物信息学方法进行了预测,同时用荧光报告载体实验证实了miR-377-3p与预测靶基因的直接作用,定量PCR和western blot进一步验证了miR-377-3p对靶基因表达的影响。最后,与miR-377-3p相同,我们用类似的方法对靶基因的功能进行了研究。结果miRNA芯片和q RT-PCR结果均表明miR-377-3p在高糖处理的HK-2细胞中明显高表达。而miR-377-3p在临床糖尿病肾病患者血清中低表达。小鼠糖尿病肾病模型构建成功,可用于后续功能研究。miR-377-3p能降低高糖诱导下HK-2细胞的细胞活性。miR-377-3p能通过上调促凋亡基因Bax和下调抑凋亡基因Bcl-2表达,促进高糖诱导下HK-2细胞的凋亡。糖尿病肾病小鼠体内进行实验,发现miR-377-3p能抑制小鼠肾小管上皮细胞的增殖,并通过上调促凋亡基因和下调抑凋亡基因表达,促进糖尿病肾病小鼠的肾小管上皮细胞的凋亡。生物信息学预测出SGK3 m RNA 3’UTR含有与miR-377-3p种子序列的结合位点,定量PCR和western blot荧光报告载体实验证实了两者的靶定关系。SGK3能挽救miR-377-3p对细胞活性的抑制作用,通过下调促凋亡基因和上调抑凋亡基因表达,抑制高糖诱导下HK-2细胞的凋亡。SGK3能促进糖尿病肾病小鼠的肾小管上皮细胞的增殖,抑制细胞凋亡。miR-377-3p还影响PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结论miR-377-3p在高糖处理的HK-2细胞中高表达,而在糖尿病肾病患者血清中低表达。miR-377-3p通过抑制细胞生长和促进细胞凋亡的方式破坏肾小管上皮细胞,加速糖尿病肾病的发生发展。miR-377-3p靶定并负调控SGK3。SGK3通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的方式,发挥与miR-377-3p相反的作用。miR-377-3p参与PI3K/AKT信号通路介导的糖尿病肾病的发生。综上所述,我们研究发现了miR-377-3p/SGK3这一与糖尿病肾病相关的调控通路,为临床理解糖尿病肾病的发病机制提供了新思路,为其治疗提供了可能的干预靶点。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9

【参考文献】