TPX2在膀胱癌发生发展中的作用及其初步分子机制研究

发布时间：2018-03-25 01:37

本文选题：TPX2　切入点：膀胱癌　出处：《郑州大学》2014年博士论文

【摘要】：在世界范围内，膀胱癌在美国是第七位最常发生的肿瘤，每年大约有13,000人因此死亡，在中国居泌尿生殖系统肿瘤发生率的第一位。膀胱尿路上皮癌作为最常见的膀胱癌亚型占所有膀胱癌的90%以上。尽管膀胱尿路上皮癌发生发展期间其诊断策略和生物分子标记研究取得了很大的进展，但是多于30%的膀胱尿路上皮癌病人复发，并最终进展为浸润型。因而，寻找和鉴定新的诊断或治疗膀胱癌病人的分子标记具有十分重要的意义。研究显示，恶性肿瘤是一种以细胞增殖、分化以及凋亡异常为特征的疾病。其主要特点是细胞的无限增殖能力和细胞周期的异常调控，这些成为肿瘤发生发展的主要原因。近年来，科研人员对肿瘤的关注逐渐转移到细胞周期的调控上，尤其是中心体，并发现中心体在调控细胞周期分布的变化以及细胞周期相关蛋白的表达中发挥重要的作用。因此中心体相关蛋白是继细胞周期，信号转导和细胞凋亡之后又一个肿瘤研究的热点。此外，越来越多的研究显示，中心体有望成为恶性肿瘤治疗的新的分子靶点，从而为恶性肿瘤的分子靶向治疗开辟了新的途径。 TPX2是目前发现的一个与中心体密切相关的蛋白，在肿瘤细胞染色体20q经常出现基因的扩增，其中常常伴有TPX2的扩增存在。此外，TPX2也是一个微管相关蛋白，主要是哺乳动物细胞在着丝粒处负责微管的组装和形成，这一过程是通过与非洲爪蟾驱动蛋白类似的蛋白2（Xenopus kinesin-like protein2，Xklp2）的羧基末端结构域的结合来介导的。TPX2是Ran-GFP的下游调控基因，在纺锤体的组装和形成中发挥重要作用。在有丝分裂早期，TPX2以依赖RanGTP的方式被释放，从而和AuroraA激酶相互作用，进而起始纺锤体的装配。TPX2的表达在细胞周期阶段被严密的调控，经常在G1向S期过渡的时期可见其表达，在细胞质分裂时表达消失。因而TPX2表达对于评估肿瘤细胞的增殖行为具有重要的价值。近几年来，许多肿瘤中呈现出TPX2的异常表达，如在非小细胞肺癌中染色体20q11.2的扩增驱动了TPX2的拷贝数显著增加，胰腺导管腺癌中高水平的TPX2mRNA和蛋白的表达以及多于50%的巨大细胞骨肿瘤病人中呈现TPX2的高表达，这些研究提示TPX2可能成为肿瘤诊断和治疗的新的分子靶点。然而，迄今为止，世界范围内均未见TPX2在膀胱癌发生发展中的作用的研究报道，因此为了初步阐明TPX2在膀胱癌发生发展中的作用，在本研究中，作者首先通过免疫组织化学，半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测膀胱癌组织和正常组织中TPX2mRNA和蛋白的表达，并通过半定量RT-PCR检测不同临床阶段和不同转移状态的膀胱癌组织中TPX2的表达，分析其表达与膀胱癌病人临床病理学参数之间的关系，并通过资料随访探讨其表达与膀胱癌病人预后之间的关系，初步探讨其在膀胱癌发生发展中的可能作用。进一步通过TPX2基因获得或缺失技术分别上调或下调膀胱癌细胞TPX2的表达，研究其表达变化对膀胱癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制。最后采用裸鼠移植瘤模型研究TPX2表达上调或下调对膀胱癌裸鼠移植瘤生长的影响。该研究有望为以TPX2为靶点的膀胱癌的分子靶向治疗提供新的实验证据。第一部分TPX2在膀胱癌组织中的表达及其在膀胱癌病人预后中的价值方法（1）采用免疫组织化学方法检测71例膀胱癌组织和相应的71例正常膀胱组织中TPX2蛋白表达。（2）采用半定量RT-PCR分析了随机选择的21例膀胱癌组织和相对应的正常组织中TPX2mRNA的表达。（3）采用实时荧光定量PCR检测随机选择的8例膀胱癌组织和相对应的正常组织中TPX2mRNA的表达。（4）采用Kaplan Meier存活曲线分析TPX2蛋白表达与膀胱癌病人预后之间的关系。（5）统计学处理：应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用X±S表示。免疫组织化学结果采用X2进行评估，半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR采用单因素方差分析（One-wayANOVA），TPX2表达和膀胱癌病人预后之间的关系采用Kaplan Meier存活曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。结果（1）TPX2主要定位于膀胱癌细胞的细胞质中。免疫组化的结果显示，TPX2在膀胱癌中高表达，在正常组织中不表达或者低表达。71例膀胱癌组织中TPX2的阳性表达率83.10%（59/71）高于正常组织12.68%（9/71），两者比较差异具有显著性（P0.05）。（2）膀胱癌组织中TPX2mRNA的相对表达水平为0.485±0.06，显著高于正常组织中TPX2mRNA的表达水平（0.051±0.006），差异具有统计学意义（P0.05）。（3）实时荧光定量PCR结果显示，每例膀胱癌组织中TPX2mRNA的相对表达水平均显著高于对应的正常膀胱组织中TPX2mRNA的表达水平，差异具有统计学意义（P0.05）。（4）TPX2蛋白表达与膀胱癌患者的性别和年龄无关（P0.05），但与患者的临床分期、组织学分级和淋巴结转移密切相关（P0.05）。最为显著的是，，在19例具有转移的膀胱癌病人中，TPX2蛋白表达的阳性率为100%。（5）膀胱癌患者处于pT2-T4阶段的组织标本中TPX2mRNA的表达水平显著高于pTa-T1阶段的膀胱癌患者，且差异具有统计学意义（P0.05）。（6）具有淋巴结转移的膀胱癌患者其TPX2mRNA的表达水平显著高于无转移的膀胱癌患者，且差异具有统计学意义（P0.05）。（7）具有TPX2高表达的膀胱癌患者的存活时间显著低于TPX2低表达或无表达的膀胱癌患者，且差异具有统计学意义（P0.05）。第二部分TPX2在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的调控作用方法（1）采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测膀胱癌T24、J82、5637和RT4细胞中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平。（2）利用脂质体2000将pcDNA3.1空载体、pcDNA-TPX2真核表达载体、TPX2siRNA和对照siRNA转染膀胱癌T24细胞，采用800μg/ml的G418筛选稳定表达TPX2和pcDNA3.1的膀胱癌T24稳定细胞株。（3）采用实时荧光定量PCR和Western blotting对转染前后的膀胱癌T24细胞株进行鉴定。（4）采用CCK-8增殖实验检测TPX2过表达或表达下调对膀胱癌T24细胞增殖的影响。（5）采用流式细胞术检测TPX2过表达或表达下调对膀胱癌T24细胞周期和凋亡的影响。（6）采用Western blotting技术检测转染前后T24细胞中cyclin D1、cdk2和p21蛋白表达的变化。（7）采用caspase-3比色分析试剂盒分析转染前后T24细胞中caspase-3活性的变化。（8）统计学处理：应用SPSS17.0软件处理数据，统计学数据用均数±标准差(X±S)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析，以P=0.05为检验水准。结果（1）T24细胞中呈现最高TPX2mRNA和蛋白的表达水平，显著著高于J82，5637和RT4细胞，差异具有统计学意义（P0.05），此外，RT4呈现出最低的TPX2mRNA和蛋白的水平，与其它细胞株相比，TPX2mRNA和蛋白的表达具有显著性差异（P0.05）。（2）pcDNA-TPX2转染组中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1转染组，且差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1转染组中TPX2mRNA和蛋白的表达无差异（P0.05）。（3）TPX2siRNA组中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和对照siRNA组中TPX2mRNA和蛋白的表达无差异（P0.05）。（4）TPX2过表达的膀胱癌T24细胞的增殖速度明显快于未处理组和空载体pcDNA3.1组，差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组相比，膀胱癌T24细胞的增殖速度无差异（P0.05）。此外，TPX2下调的膀胱癌T24细胞的增殖速度明显慢于未处理组和对照siRNA组，差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和对照siRNA组相比，膀胱癌T24细胞的增殖能力无差异（P0.05）。（5）pcDNA-TPX2组中T24细胞在G0/G1期的细胞数比率显著低于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中T24细胞在G0/G1期的细胞数比率无差异（P0.05），而S期细胞数的比率在三组之间无差异（P0.05），而G2/M期的细胞数比率显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P0.05）。此外，TPX2siRNA组中T24细胞在G0/G1期的细胞数的比率显著高于未处理组和对照siRNA组，而S期和G2/M期的细胞数的比率显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和对照siRNA组在细胞周期的各个时相上细胞数的比率无差异（P0.05）。（6）TPX2表达上调显著上调膀胱癌T24细胞中cyclin D1和cdk2蛋白的表达，而显著下调p21蛋白的表达，且具有统计学差异（P0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中上述蛋白的表达无差异（P0.05）。进一步研究显示，TPX2表达下调显著降低膀胱癌T24细胞中cyclin D1和cdk2蛋白的表达，而显著增加p21蛋白的表达，且具有统计学差异（P0.05），而未处理组和对照siRNA组中上述蛋白的表达无差异（P0.05）。（7）与未处理组和空载体pcDNA3.1组相比，pcDNA-TPX2组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著降低，且差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均无统计学差异（P0.05）。此外，与未处理组和对照siRNA组相比，TPX2siRNA组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著升高，且差异具有统计学意义（P0.05），而未处理组和对照siRNA组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均无统计学差异（P0.05）。（8）TPX2表达上调显著降低膀胱癌T24细胞中caspase-3的活性，且具有统计学差异（P0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中caspase-3的活性无差异（P0.05）。进一步研究发现，TPX2表达下调显著提升膀胱癌T24细胞中caspase-3的活性，且具有统计学差异（P0.05），而未处理组和对照siRNA组中caspase-3的活性无差异（P0.05）。第三部分TPX2表达变化在膀胱癌裸鼠移植瘤生长中的作用方法（1）实验分组：TPX2过表达分组：未处理组：接种未经任何处理的膀胱癌T24细胞；空载体转染组：接种稳定表达空载体pcDNA3.1的膀胱癌T24细胞；pcDNA-TPX2组：接种过表达TPX2的膀胱癌T24细胞。TPX2表达下调分组：未处理组：不进行任何治疗；对照siRNA组：肿瘤内注射对照siRNA进行治疗；TPX2siRNA组：肿瘤内注射TPX2siRNA进行治疗。（2）对于TPX2过表达实验，接肿膀胱癌T24细胞后，当瘤体达到80mm3左右时，每隔3天记录肿瘤的体积，当记录全部结束后，绘制肿瘤生长曲线，并剥离肿块，称量瘤体重量，比较不同组别的肿瘤重量。对于TPX2表达下调的实验，待肿瘤长到55-80mm3时，每3天注射一次对照siRNA和TPX2siRNA（100ng/μl），并每隔3天记录肿瘤的体积，当记录全部结束后，绘制肿瘤生长曲线，并剥离肿块，称量瘤体重量，比较不同组别的肿瘤重量。（3）采用实时荧光定量PCR检测不同组别的膀胱癌T24细胞的裸鼠移植瘤中TPX2mRNA的表达水平。（4）采用Western blotting检测不同组别的膀胱癌T24细胞的裸鼠移植瘤中TPX2蛋白的表达水平。（5）统计学处理：所有的实验数据采用统计学软件SPSS17.0进行处理，数据采用x±s表示，多个样本的均数采用单因素方差分析。P0.05，表示具有统计学差异。结果（1）TPX2过表达的T24细胞的裸鼠肿瘤组织中的TPX2mRNA和蛋白表达水平显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P0.05）。（2）TPX2siRNA治疗后的膀胱癌裸鼠肿瘤组织中的TPX2mRNA和蛋白表达水平显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P0.05）。（3）TPX2过表达组中裸鼠肿瘤的重量显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P0.05）。（4）TPX2表达下调组中裸鼠肿瘤的重量显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P0.05）。（5）TPX2表达上调显著加速裸鼠肿瘤的生长，而TPX2表达下调显著抑制裸鼠肿瘤的生长。结论（1）TPX2的高表达与膀胱癌的发生发展密切相关。（2）TPX2可能成为膀胱癌转移和预后的分子标记。（3）TPX2的过表达加速膀胱癌T24细胞的增殖、缩短G0/G1期的细胞数的比率和抑制细胞凋亡。而TPX2表达下调抑制膀胱癌T24细胞的增殖、增加G0/G1期的细胞数的比率和诱导细胞凋亡。（4）TPX2介导的细胞周期和凋亡变化与cyclin D1、cdk2、p21和caspase-3的表达或活性变化密切相关。（5）TPX2过表达显著促进裸鼠肿瘤的生长，并显著增加其重量，而TPX2表达下调显著抑制裸鼠肿瘤的生长，并且显著降低其重量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.14

【参考文献】