糖尿病大鼠肾组织Nrf2、Trx的表达及金属硫蛋白对其干预作用的研究

发布时间：2018-03-25 02:08

  本文选题：糖尿病肾病　切入点：金属硫蛋白　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：本课题拟建立1型糖尿病大鼠模型，测定大鼠肾组织中氧化应激指标丙二醛（MDA）含量及总抗氧化能力（T-AOC）活性，应用免疫组织化学、反转录PCR等方法检测肾组织的Nrf2、Trx表达情况，并给予金属硫蛋白（metallothionein,MT)干预，探讨糖尿病大鼠肾脏是否存在氧化应激状态及金属硫蛋白的干预效果，以其延缓肾损伤的发生发展。为人类糖尿病肾脏损伤的防治提供试验性的理论依据。 糖尿病时机体处于氧化应激状态，其脂质过氧化产物增多，细胞抗氧化能力下降。Nrf2-ARE通路是机体最重要的抗氧化应激通路之一。核因子EF-E2相关因子（Nrf2）在受到活性氧(ROS)的刺激时通过与ARE作用元件相结合，启动下游保护性基因蛋白转录，其中包括硫氧还蛋白（Trx）、醌氧化还原酶（NQO1）、血红素氧合酶1(heine oxygen ase1，HO-1)等，提高机体抗氧化能力，减少氧化应激损伤。 方法：选择SPF级雄性大鼠48只，体重约180~220g，（购自河北医科大学动物中心），先适应性喂养1周后，空腹12小时，随机分为正常对照组(NC组，n=12)、糖尿病模型组(DM组，n=12)、糖尿病金属硫蛋白高剂量治疗组(MTH组，n=12)、糖尿病金属硫蛋白低剂量治疗组(MTL组，n=12)。其中DM组、MTH组、MTL组大鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(65mg/k g)制备糖尿病大鼠模型, NC组则给予等量的柠檬酸缓冲液。72h后检测血糖，血糖≥16.7mmol/L视为糖尿病模型制备成功。MTH组大鼠给予0.5mg／k g MT灌胃，MTL组大鼠给予0.1mg／k g MT灌胃，NC组、DM组每天给予等量的生理盐水灌胃。分别于造模成功后6周、12周末，每组任取6只大鼠，测定24h尿蛋白(24hUP)、血肌酐、尿素氮。并收集肾组织标本，制作组织切片，在显微镜下观察苏木素伊红（HE）染色及糖原染色（PAS）的大鼠肾组织病理变化，检测肾脏丙二醛(MDA)含量、T-AOC活性，免疫组化方法检测Nrf2、Trx的表达，RT-PCR法检测Nrf2、TrxmRNA表达。实验所得数据用均数±标准差(x±S)表示，应用SPSS19.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析，不满足正态性和方差齐性的数据资料采用非参数检验，以p0.05有统计学意义。 结果： 1一般状况：DM组、MT组大鼠在注射STZ后逐渐出现多饮、多食、多尿，反应迟缓，且体重逐渐下降，毛发失去光泽，其中DM组症状明显重于MT组，而NC组大鼠生长发育良好，反应灵敏，饮食正常。 2生化指标 2.124小时尿蛋白定量：6周末，与NC相比，DM组大鼠24小时尿蛋白水平升高（p0.05）；与DM组相比，MTH组24小时尿蛋白下降（P 0.05），MTL组无明显差异（p＞0.05）。给药12周末，与NC相比，DM组大鼠24小时尿蛋白水平升高（P 0.05）；与DM组相比，各给药组均能降低大鼠24小时尿蛋白水平（p 0.05）。 2.2血肌酐、尿素氮：6周末，与NC相比，DM组大鼠血肌酐、尿素水平升高（p 0.01）；与DM组相比，各给药组血肌酐、尿素水平下降（p 0.05）。给药12周末，，与NC相比，DM组大鼠血肌酐、尿素水平升高（p 0.01）；与DM组相比，各给药组均能显著降低大鼠血肌酐水平以及尿素水平（p0.01）。 3氧化应激指标 3.1MDA的比较：6周末，与NC组相比，DM组大鼠肾组织内的MDA水平显著升高（p 0.05）；与DM组相比，各给药组的MDA水平均有不同程度的下降。12周末，与NC组相比，DM组大鼠肾组织内的MDA水平明显升高（p0.05）；与DM组相比，各给药组均能显著降低大鼠肾组织内的MDA水平（p 0.05）。 3.2T-AOC的比较：6周末，与NC组相比，DM组大鼠肾组织内的T-AOC活性显著降低（p 0.05）；与DM组相比，各给药组的T-AOC活性显著增高（p 0.05）。12周末，与NC组相比，DM组大鼠肾组织内的T-AOC活性显著降低（p 0.05）；与DM组相比，MTL组肾组织内的T-AOC活性升高（P 0.05），MTH组升高（p 0.05）。 4组织化学变化：光镜显示, NC组大鼠的肾脏组织结构清晰，未见明显的病理改变。12周末时，与同期正常组的肾组织相比, DM组肾小球体积增大，肾小球系膜基质弥漫增多,系膜细胞增多，基底膜增厚。同期MT组肾脏的病理结构得到改善。 5免疫组织化学结果：糖尿病大鼠肾脏组织于6周、12周末，DM组与NC组比较肾组织中Nrf2的表达增多，MTL组高于DM组，MTH组高于MTL组（p＜0.05）；6周末DM组较NC组Trx表达升高，但低于同期MTL组、MTH组(p＜0.05)；12周末DM组Trx较NC组减少，MTL组高于DM组，MTH组高于DM组（p＜0.05）。 6Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)结果：DM组、MTH、MTL组与NC组比较大鼠肾组织中Nrf2的表达增多，其中12周末增多更为显著（p＜0.05）；6周末DM组较NC组Trx表达升高，且低于同期MTL组、MTH组(p＜0.05)；12周末DM组Trx较NC组减少，MTL组高于DM组，MTH组高于DM组（p＜0.05）。 结论： 1糖尿病大鼠肾组织MDA含量增多，T-AOC活性下降，且糖尿病肾组织Nrf2、Trx表达较正常组明显增多，显示存在明显的氧化应激状态，Nrf2通路被激活。 2金属硫蛋白可以减少糖尿病大鼠蛋白尿的产生及减轻肾脏病理形态学改变，且降低肾组织MDA含量，提高T-AOC的活性，其机制可能与上调Nrf2蛋白及其下游抗氧化蛋白Trx的表达有关，从而减轻氧化应激，起到保护肾脏的作用。
[Abstract]:Objective: This study intends to establish a rat model of type 1 diabetes mellitus, indicators of oxidative stress in renal tissues of rats in the determination of malondialdehyde (MDA) content and total antioxidant capacity (T-AOC) activity, immunohistochemistry, reverse transcription PCR of renal tissue detection methods such as Nrf2, Trx expression, and metallothionein (metallothionein MT) intervention, intervention effect on kidney of diabetic rats whether oxidative stress and metallothionein, which delay the occurrence and development of renal injury. For the prevention and treatment of diabetic kidney damage human provide experimental theory basis.
Diabetes and oxidative stress in the body, the lipid peroxidation increased, antioxidant capacity decreased the cell.Nrf2-ARE pathway is one of the most important antioxidant pathway. The nuclear factor EF-E2 related factor (Nrf2) by reactive oxygen species (ROS) stimulation by combining with ARE elements, activate the downstream protective gene transcription, including thioredoxin (Trx), quinone oxidoreductase (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1 Heine, oxygen ase1, etc.), improve the antioxidant capacity, reduce oxidative stress injury.
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本文编号：1661055