大鼠肾移植急性排斥反应模型中血清趋化因子CXCL9和CXCL10的表达及意义

发布时间：2018-03-28 00:28

本文选题：肾移植　切入点：急性排斥反应　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景:肾移植是终末期肾功能衰竭目前最佳的治疗方法,是二十世纪生命科学领域具有代表性的重大成就,也是今后终末期肾病治疗的主要方向之一。新型免疫抑制剂的开发和应用,外科手术技术的改良和护理的精心加强,使移植病人和移植肾脏的存活在近十年来有了显著的提高。但肾移植术后急性排斥反应的发生与反复发作使移植肾功能损伤;而目前,肾移植术后急性排斥反应的诊断尚缺乏敏感高效的特异指标,临床难以及时防治,最终导致移植肾功能损害。所以,寻求早期监测诊断方法,对保护和延长移植肾功能,至关重要。移植肾活检是诊断肾移植术后急性排斥反应的金标准。但在病理作出急性排斥反应诊断的同时,移植肾已经出现了不同程度的损伤,其功能也已经受到了影响。为能更早期地发现亚临床急性排斥反应,学者们提出肾移植术后移植肾定期序贯穿刺活检。移植肾穿刺是一种有创的检查方法,伴随一定程度的并发症,对于已出院病人行移植肾穿刺活检更是非常困难。因此,寻找一种无创、新型、高敏感性和特异性的前期预警诊断方法,成为国际移植界关注的焦点。而有学者提出急性排斥反应的发生是一个时间连续性的统一事件,当急性排斥反应发生初期仅出现某些特定分子的微小改变时,就及时对肾移植患者进行早期干预,可望有效阻止移植肾的进一步损伤。所以,在肾移植术后早期进行分子监测是一项重要的策略。趋化因子是一类包含4个保守半胱氨酸残基,具有化学趋化功能的多肽,其分子量多在8-12kDa之间。根据第1及第2个半胱氨酸之间所含其它氨基酸的的结构特点,可划分为4个亚族,分别为C、CC、CX3C、及CXC。趋化因子的主要作用是吸引免疫细胞到达免疫应答局部,参与免疫调节以及病理反应。IFN-γ诱导的单核因子(CXCL9/MIG)和IFN-γ诱导的10kDa的蛋白(CXCL10/IP-10)均为趋化因子CXC亚族的一员,二者均属于ELR-型趋化因子,是一种重要的血管稳定因子,在体内外均被证明有抑制血管生成作用。CXCL9可以反应炎症前期状态,可能是预警移植并发症的发生的有价值的标记物。而CXCL10在炎症等生物学过程中起重要作用,且是在同种异体肾移植术后检测到的第一个配体。CXCL9和CXCL10在干扰素γ信号通路中处于下游并吸引CXC类趋化因子受体3(CXCR3+)T细胞进入移植物,其对T淋巴细胞的募集效应可能在急性排斥反应发展过程中起关键作用,且通过不断循环产生放大其效应,二者的受体CXCR3和TH1 T细胞活化紧密相关并被证明对移植排斥有很高的预警价值。此外,国外有学者报道CXCL9和CXCL10可能与最早期急性排斥反应的发生有关联。由此可见,CXCL9和CXCL10可能是肾移植术后急性排斥反应容易监测的理想生物标记物。由于趋化因子在急性排斥反应时期驱动免疫细胞分化、迁移和增殖中的起到了关键作用,因此其在血液循环的水平和移植受者的免疫状态严密相关。国外有学者提出在确立术后血清中结合CXCR3的趋化因子在移植结局预测价值方面及外周血趋化因子表达在肾移植排斥反应中的价值有待研究。血清CXCL9、CXCL10在肾移植急性排斥反应前期可能起关键作用,其不但可能具有很高的诊断价值,更有可能成为急性排斥反应前期理想的干预靶点。而目前肾移植术后血清CXCL9和CXCL10水平与肾移植术后急性排斥反应的关系仍缺乏研究。在生物标记物的检测中,分析的客观、具有可验证性及统一的标准是很重要的。由于当前进行具有这些特性的人群大样本分析尚不能做到,这就提示我硕士学位论文们进行一定数量的动物模型实验对血清CXCL9和CXCL10在肾移植急性排斥反应中的作用进行研究是有必要的。而我们在前期工作中已成功建立大鼠、兔肾移植与大鼠肝、肾、胰器官簇移植的动物模型,并证实了 CD44是早期诊断急性排斥反应的预测因子,动态监测CD3、CD69、CD25及CD71的表达有助于急性排斥的早期诊断和鉴别诊断等。目的:本研究关注于CXCL9和CXCL10在肾移植术后急性排斥反应大鼠血清中的表达及意义。通过改良方法成功建立大鼠肾移植急性排斥反应模型,选择移植肾脏进行病理学评分和诊断,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对肾移植术后急性排斥反应大鼠血清CXCL9和CXCL10水平进行检测以期能够为肾移植术后急性排斥反应发生前期的诊断研究提供可选的生物标记物。方法:一、大鼠肾移植急性排斥反应模型的建立1.动物分组健康雄性Brown Norway(BN)和Lewis近交系大鼠,体质量为200-250g,随机分为两组:①异基因移植组为急性排斥组(ARx,n=15),BN大鼠为供体,Lewis大鼠为受体;②同基因移植组为对照组(con,n=15),供受体均为Lewis大鼠。动物饲养于空调恒温动物房,室温控制在20～25℃,大鼠自行饮水进食,保持24小时正常昼夜节律,饲养适应环境一周后开始实验。2.手术方式大鼠肾动脉吻合采用端-侧连续缝合;肾静脉采用端-端一侧静脉壁采取连续缝合,另一侧采用间断缝合;输尿管采用带有膀胱瓣的供体输尿管与受体膀胱进行连续缝合,在供、受体左侧进行同种异体原位肾移植手术。术后观察大鼠一般状态,包括精神状态、饮食活动情况、体重变化、大便性状等,手术成功的大鼠在术后第一天精神状态逐渐好转,可自由饮水,活动性好,对外界刺激反应较灵敏,应预防术后并发症的发生,存活超过3天认为手术成功。二、肾移植急性排斥反应大鼠血清中趋化因子CXCL9和CXCL10表达1.样品采集于术后3、5、7天分别处死5只大鼠,切取移植肾。每只经腹主动脉取血6-10ml,4000 rpm离心10 min后,取0.3ml血清做肌酐(Cr)检测,余下血清-80℃冻存待检。2.移植肾组织学检查移植肾组织放入10%中性福尔马林溶液固定,连续切片(3μm)后做HE染色,移植肾病理诊断参考banff97标准并对急性排斥反应严重程度进行半定量评分(0=正常,1=交界性改变,2=ⅠA,3=ⅠB,4=ⅡA,5=ⅡB,6=Ⅲ)。3.血清 CXCL9、CXCL10 检测采用ELISA方法检测血清CXCL9、CXCL10表达,按说明书进行操作,,最后在450 nm条件下读取OD值,利用专业标准曲线制作软件"Curve Exert 1.4"计算样本浓度,所有样本均做复孔检测。结果:1.大鼠肾移植急性排斥反应模型的建立共进行大鼠同种异体肾移植手术45次,成功率达86.7%。其中死亡6只,分别为麻醉意外1只、低血容量1只、血栓2只、低体温2只。动脉吻合时间(15±1.5)min,静脉吻合时间(15±1)min,总时间(30±2)min。2.病理变化半定量评分显示ARx组和con组第3、5、7天急性排斥反应严重程度差异均有显著统计学意义(P0.01)。con组第3、5、7天的半定量评分彼此均无显著统计学差异(P0.05);在ARx组,第3天的半定量评分与第5、7天均有显著统计学差异(P0.05),而第5天与第7天的半定量评分无显著统计学差异(P0.05)。根据半定量评分平均数比较ARx组第3、5、7天分别发生轻、中、重度排斥,对照组无明显排斥现象。3.肾移植术后血肌酐变化ARx组第3、5、7天血Cr表达持续升高,各不同时间组之间表达均有显著统计学差异(P0.05);与对照组比较差异均具有显著性(P0.01)。4.肾移植术后大鼠血清CXCL10表达ARx组第3、5、7天血清CXCL10表达持续升高,第5天和第7天比较具有显著统计学差异((P0.05),第3天和第5天差异无显著性(P0.05);与对照组比较第3、5、7天血清CXCL10表达差异均具有显著性(P0.01)。5.肾移植术后大鼠血清CXCL9表达ARx组第3、5、7天血清CXCL9表达与对照组比较显著升高(P0.01);ARx组血清CXCL9表达不显示呈升高趋势,第3天、第5天分别于第7天比较具有显著统计学差异(P0.05),第3天和第5天差异无显著性(P0.05);第7天血清CXCL9表达较第3天和第5天显著降低。结论:1.大鼠肾移植急性排斥反应模型的建立采用肾静脉端端吻合,供肾带有腹主动脉的肾动脉与腹主动脉的端侧吻合及带有膀胱瓣的输尿管膀胱吻合的方法可成功建立大鼠肾移植急性排斥模型。这种改良术式简单、稳定,易被初学者掌握学习。2.肾移植术后血清中CXCL9和CXCL10表达与急性排斥反应发生关系密切,可能对急性排斥反应发生具有早期诊断价值。3.CXCL9和CXCL10在急性排斥反应发生发展过程中起共调因子作用,其表达可能呈现相互抵抗、互相平衡的典型趋势的改变,这为非侵袭联合监测方式诊断肾移植术后急性排斥反应发生提供了新的思路。
[Abstract]:Abstract : Renal transplantation is one of the most important therapeutic methods in the field of renal transplantation . It is an important strategy for the diagnosis of acute rejection after renal transplantation . The study of serum CXCL9 and CXCL10 in acute rejection after renal transplantation has been successfully established in the early stage of renal transplantation . Serum CXCL9 and CXCL10 were detected by ELISA . The results were as follows : 1 . Serum CXCL9 and CXCL10 were detected by ELISA .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R699.2

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