8号染色体上调表达基因与前列腺癌相关性的基础和实验研究

发布时间：2018-03-28 01:39

本文选题：前列腺癌　切入点：基因芯片　出处：《南方医科大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景及目的：前列腺癌(Prostate cancer, PCa)为男性生殖系统常见的恶性肿瘤,目前被公认为是男性人群所面临的最重要的医学难题之一。在欧美国家前列腺癌是最常见的实体肿瘤,其病例数已超过肺癌和大肠癌,成为第1位危害男性健康的肿瘤。就全球范围来看,我国目前虽然处在前列腺癌低发地区,但据保守估计：我国前列腺癌发病数和死亡数均将呈上升趋势。至2030年,发病数和死亡数的上升幅度达106.4%和111.4%,平均每年上升4.8%和5.1%。上海市统计数据显示前列腺癌已从1991年的29/10万男性(标化率24/10万)上升到2001年的1214/10万男性(标化率678/10万)。所以从现阶段开始,深入研究前列腺癌的发生、发展过程及疾病转归规律,对前列腺癌的预防及治疗具有重大的科研和临床意义。目前有关前列腺癌的病因及致病机制仍不十分清楚,相关癌基因的异常激活及其表达产物在前列腺癌的发生发展过程之中起重要作用。前列腺癌的发生发展是一个由多基因参与,多阶段逐渐演变的过程；一直以来,基因组的改变被认为加速了肿瘤的发生发展过程；在前列腺癌的发展过程中,这种基因组的改变与肿瘤发生的早晚期事件相关。遗传因素是前列腺癌发生的一个重要危险因素,因此：前列腺癌的遗传学研究有助于为前列腺癌发病机制的研究提供数据和寻找中国人群特异性的前列腺癌标记物。研究表明8号染色体与前列腺癌有关,8号染色体短臂的缺失被认为是前列腺癌的早期事件,见于前列腺上皮内肿瘤及几乎所有的前列腺癌中。但是,近年来8号染色体长臂8q的扩增尤其是(8q21-24区域)被认为与前列腺癌的发生及侵润性进展有关。研究前列腺癌8号染色体上基因异常扩增的改变情况,寻找前列腺癌潜在的候选癌基因,并研究这些基因在前列腺癌发生发展中的变化和作用机制对于揭示前列腺癌的发生发展机理以及临床诊断分子靶标有重要意义。基因芯片是在90年代中期发展出来的高科技产物,大小如指甲盖一般,每个芯片的基面上都可划分出数万至数百万个小区。在指定的小区内,可固定大量具有特定功能、长约20个碱基序列的分子探针。由于被固定的分子探针在基质上形成不同的探针阵列,利用分子杂交及平行处理原理,基因芯片可对遗传物质进行分子检测。因此可用于进行基因研究、法医鉴定、疾病检测、药物筛选、癌症的精确认断及治疗；此外还能对癌症的发生、发展和转归进行预测。传统分子生物学方法只能针对某一基因进行研究,而基因芯片可以一次性检测和分析成千上万种肿瘤相关基因,有助于发现肿瘤形成、发展和转移的机理,在泌尿系肿瘤的诊断、治疗方面的应用有着广泛的前景。本研究亦通过基因芯片在前列腺癌和癌旁良性组织中筛选前列腺癌8号染色体上调表达的基因,分析这些基因的生物信息行为；再结合MILANO网站筛选8q21-24区域上调表达基因,验证筛选基因在前列腺癌细胞和组织中基因表达,扩增和蛋白表达情况。研究这些异常表达基因及其相关蛋白与前列腺癌临床病理之间的相关联系,比较筛选基因分子和临床水平生物学行为的异同,以期望在8q21-24区域能寻找到新的与前列腺癌发病和进展相关的潜在肿瘤标记物。研究材料： 1：用于基因芯片检测和候选癌基因验证实验的前列腺癌和良性前列腺组织均为在我院住院的患者中收集。4例癌-癌旁组织标本送芯片检测。另外用于候选基因验证的前列腺癌标本10例,患者平均年龄73.9岁,PSA≥4有9例,Gleason≥8有6例。 2：前列腺癌PC3/DU145/LNCap细胞系和永生化的前列腺上皮细胞系RWPE-1为我院实验室保存。 3：免疫组化实验的前列腺癌组织芯片标本购买于美国Creative Bioarray公司。共100例前列腺癌标本,平均年龄68.1岁、PSA≥4的有90例、Gleason≥8的有27例。研究方法： 1：收集我院住院患者的4对前列腺癌及其癌旁临床组织样本,通过激光显微切割获取较纯净的癌和癌旁组织。提取并纯化样本组织的总RNA用作基因芯片杂交、通过Agilent基因芯片作RNA检测、分析芯片数据,筛选出差异表达基因。根据基因芯片分析结果结合Agilent软件分析,表达倍数高于1.5倍的基因被认为是高表达的基因。在8号染色体上癌组织与癌旁组织相比,筛选出高表达的基因。 2：通过基因芯片数据分析网站Panther聚类分析8号染色体上调表达基因的生物学行为；String网站分析筛选蛋白相互作用网络图。 3：通过MILANO网站分析,整合8号染色体8q21-24区域。将8号染色体差异表达的基因输入Primary Search Term框内,然后将Oncogene和Cancer输入到Secondary Search Term框内,搜索Pubmed整个数据库得到最终的上调表达基因列表。 4：收集的10例前列腺癌和10例良性前列腺组织标本及前列腺癌PC3/DU145/LNCaP细胞系对8q21-24区域候选基因行mRNA RT-qPCR检测,以验证候选基因在前列腺癌和细胞系中的表达情况,是否符合表达谱芯片数据。 5：对mRNA验证符合表达谱数据的基因,再通过DNA-qPCR方法检测10例前列腺癌和良性前列腺组织标本及前列腺癌PC3/DU145/LNCaP细胞系候选基因DNA拷贝数改变情况。 6:Western blot验证候选蛋白在10例前列腺癌和良性组织表达的差异情况。 7：大样本组织芯片免疫组化实验检测候选蛋白在前列腺癌和良性组织中表达的差异情况。统计学处理：使用SPSS17.0软件进行数据统计。正态分布的计量资料数据以”x±s”表示,采用两独立样本t检验分析候选癌基因和蛋白在前列腺癌和良性组织之中的差异表达情况,方差不齐则采用t’检验。多组均数间比较用one-way ANOVA分析,组间比较用LSD分析。Wilcoxon秩和检验比较候选蛋白在前列腺癌和良性组织中染色强度变化,Pearson卡方检验分析候选蛋白在前列腺癌组织中的免疫组化评分与患者临床病理参数之间的关系。所有统计资料P0.05认为有统计学意义。结果：1：表达谱基因芯片Whole Human Genome Microarray(4x44K)(Agilent)检测4组配对前列腺癌和癌旁组织的基因差异表达情况,在前列腺癌8号染色体共筛选出上调表达1.5倍的基因21个(GHLHE22、C8orf38、C8orf51、CTHRC1、 DSCC1、E2F5、FAM49B、FAM86B2、hCG-19905、INTS8、LOC389641、MTFR1、 MYC、OSGIN2、PAG1、PBK、POLB、TMEM65、TNFRSF19A、UBXN2B、 ZMAT4。 2：8号染色体上调表达基因涉及多种分子水平生物学行为,E2F5和MYC两个基因分子水平生物学行为相似度较高(都属于结合类因子,都具有细胞调控作用,都属于转录因子蛋白和细胞核蛋白成分；E2F5和MYC，DSCC1和PBK蛋白之间有相互作用。 3：整合8q21-24区域最后确定上调表达的6个基因:CTHRC1、PAG1、FAM49B、 TMEM65、MYC、E2F5。 4：在10例前列腺癌和良性组织中,E2F5及MYC基因的在前列腺癌组织中表达一致性显著高于良性组织(P0.05)；PAG1、FAM49B、TMEM65在前列腺癌中的表达也高于良性组织(P0.05)。在细胞系方面：E2F5在3个前列腺癌细胞株中的表达均高于永生化的前列腺上皮细胞株RWPE-1(P0.01),而MYC在LNCap和Du145细胞系中的表达明显高于永生化的前列腺上皮细胞(P0.01),在PC3细胞中表达却不明显；CTHRC1在PC3和DU145中的表达相比正常细胞差异明显(P0.01);PAG1和TMEM65在DU145以及LNCap中的表达相比正常细胞差异明显(P0.01)。 5： E2F5在前列腺癌中基因拷贝数明显高于良性组织(P0.001),在PC3和LNCap细胞系中基因拷贝数高于正常的永生化前列腺上皮细胞RWPE-1(P0.01),但是在DU145细胞系中基因拷贝数无明显变化。MYC在前列腺癌中基因拷贝数明显高于良性组织(P0.001),细胞系方面在LNCap细胞系中基因拷贝数高于正常的永生化前列腺上皮细胞RWPE-1(P0.01)。 6:Western blot结果表明E2F5及MYC蛋白在前列腺癌组织中的表达均高于良性组织(P0.001)。 7：免疫组化结果显示E2F5和MYC蛋白在前列腺癌组织中表达增加(P0.001)。而且,E2F5的过表达与高的临床分期(P0.001)、阳性转移(P0.001相关；MYC的过表达与阳性转移(P0.001)相关。结论： 1.应用基因芯片筛选前列腺癌肿瘤标记物是一种行之有效的方法。 2.定位于染色体8q21-24区域PAG1、FAM49B、TMEM65这3个基因表达增加可能与前列腺癌有关。 3.定位于染色体8q21-24区域的E2F5和MYC基因在前列腺癌组织和细胞中均表达增加,并且和前列腺癌的临床分期和转移相关。 4. E2F5、MYC在前列腺癌中基因拷贝数增加,说明这两个基因在前列腺癌的遗传发病中起一定作用。 5.E2F5和MYC分子水平和临床水平生物学行为较为一致,推测二者协同作用在前列腺癌的遗传发病和临床进展中起重要作用,E2F5和MYC可作为前列腺癌潜在癌基因。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.25

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