警报素IL-33介导狼疮肾炎炎症损伤的研究

发布时间：2018-04-09 15:31

本文选题：系统性红斑狼疮　切入点：警报素　出处：《广州医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的：系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种遗传、性激素、环境、感染等多因素参与其中的特异性自身免疫性疾病，其特征性表现为全身多系统和脏器受累，血清中存在大量自身抗体。肾脏是SLE最容易受累的靶器官，狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE最重要的临床表现之一。LN对患者预后影响极大，肾功能衰竭是SLE的三大主要死亡原因之一。目前LN的致病机制仍未完全清楚，治疗仍以传统抗慢性风湿病药物（Diseases ModifyingAntirheumatic Drugs,DMARDS）为主，生物制剂的出现虽然带来了更多的治疗选择，但效果仍不尽人意。因此，针对LN疾病机制的深入研究以及新药开发，依然任重道远。固有免疫系统异常在SLE发病早期即出现，甚至早于临床表现，而且贯穿整个疾病过程。病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）是固有免疫系统识别外源性和内源性危险信号的方式。他们可以被表达于免疫细胞上的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）所识别，从而启动免疫应答。警报素是机体组织细胞损伤时所释放的内源性危险分子。当机体细胞坏死或免疫细胞受到炎症刺激时，警报素通过被动或主动的方式释放到细胞间质中，与免疫细胞特异性受体结合，激活胞内信号通路，诱导炎症反应，募集趋化单核/巨噬细胞、中性粒细胞和特异性T细胞，从而启动固有免疫和调节特异性免疫反应。在自身免疫性疾病中，由于自身免疫紊乱，警报素往往作为炎症因子参与疾病的损伤过程，从而加重组织损伤并形成恶性循环。目前警报素在SLE、类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)、系统性硬化、干燥综合征、炎症性肠病等自身免疫性疾病疾病被广泛研究。不同的警报素之间具有类似的免疫激活模式。白介素-33（interleukin-33,IL-33)是警报素的最新成员，其受体包括表达在免疫细胞表面的特异性受体ST2，以及被分泌到细胞外可以导致IL-33失活的诱骗受体可溶性ST2(Soluble ST2，sST2)。IL-33/ST2信号通路的激活，可激活受体细胞下游有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）及结合核因子κB（NF-κB），从而介导大量炎症因子产生，造成自身免疫性组织受损。动物体内实验证明，予sST2治疗可以减轻RA、药物诱导急性肾损伤、哮喘等疾病的炎症受损。临床研究发现, SLE患者血清IL33/sST2显著升高，而且升高水平与狼疮疾病活动度指数评分（SLEDAI）呈正相关。SLE动物模型予以抗IL-33抗体治疗可以减轻狼疮肾炎病情。以上研究提示IL-33/ST2通路可能以肾脏为靶点而参与SLE免疫激活，而拮抗该通路的激活有望成为治疗LN的新途径。但目前关于IL-33/ST2通路如何参与狼疮肾炎炎症性损伤的机制仍不甚明了。本研究旨在阐明：IL-33是否来源于肾脏，，储备释放细胞是什么细胞，其表达水平是否可反应肾脏受损程度；外周血表面表达ST2受体是什么免疫细胞，以及IL-33与表达ST2受体的免疫细胞是如何通过相互作用导致肾脏炎症损伤等问题。材料和方法： 1、SPF级8周龄雌性MRL/lpr狼疮小鼠以及同龄雌性C57BL/6J健康小鼠各5只，动态观察2组小鼠一般情况以及检测尿蛋白水平。18周龄时处死，检测血清ds-DNA、血清肌酐、尿素水平，行肾组织HE、PASM、MASSON染色观察肾脏病变。 2、Real time PCR方法检查2组小鼠肾组织IL-33mRNA表达水平。western blot检测肾组织IL-33蛋白表达水平。分析IL-33表达水平与尿蛋白、血清ds-DNA的相关性。 3、通过免疫组化技术，定位IL-33在肾组织的表达位置，进一步通过免疫荧光双染定位IL-33的表达细胞来源。 4、流式细胞术检测SLE患者及健康体检者外周血CD4+T细胞和CD14+单核细胞表面ST2受体的表达水平。使用软件Image J进行图像分析，所有数据用SPSS17.0统计软件处理，正态分布并且方差齐同的定量资料以均数±标准差表示，偏态分布资料以中位数表示，2组间均数比较采用t检验或秩和检验。等级资料组间比较采用秩和检验，相关性分析采用spearman相关系数。p0.05表示差异有统计学意义。结果： 1、小鼠一般情况及尿蛋白水平 2组动物在处死前均存活，C57组精神状态良好，食欲良好，活跃，皮毛有光泽，未见脱毛，四肢关节无肿胀。MRL/lpr组精神状态一般，食量较对照组减少，懒动,小鼠全身不同程度浮肿。浅表处可触及数量不等肿大淋巴结。皮毛颜色缺少光泽，但未见明显脱毛。部分小鼠后膝关节轻度-中度肿胀。尿蛋白从14周龄开始检测，每隔2周一次，MRL/lpr组所有小鼠均出现了不同程度的蛋白尿，但整体上没有出现尿蛋白进行性增多趋势。C57组所有小鼠尿蛋白均为阴性。 2、小鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及ds-DNA的测定 MRL/lpr组血清BUN为10.04±1.79mmol/L，C57组为7.42±1.00mmol/L，2组之间差别无统计学意义（P=0.300）；MRL/lpr组血清Scr为25.60±7.30ummol/L，C57组为25.75±8.54ummol/L，同样2组之间差别无统计学意义（P=0.878）。血清ds-DNA，MRL/lpr组均为阳性（2+～4+），而C57组则未见阳性表达，2组之间差异有统计学意义（p=0.003）。 3、普通及特殊病理切片结果 HE染色：C57小鼠肾组织可见肾小球结构显示清晰，小球内可见血管袢；MRL/lpr狼疮小鼠则见肾小球明显肥大，结构紊乱，小球及肾间质可见大量淋巴细胞浸润。PASM染色：MRL/lpr狼疮小鼠可见肾小球基底膜明显增厚，内皮及上皮细胞增生明显；而C57小鼠基底膜基本正常，未见明显内皮及上皮细胞增生。MASSON染色：MRL/lpr狼疮小鼠可见肾小球内大量嗜红免疫复合物沉积，肾小管内可见大量蛋白管型；而C57小鼠肾小球结构清晰，未见免疫复合物沉积，肾小管管腔未见蛋白管型。 4、IL-33在肾组织的表达水平 MRL/lpr组较C57组表达IL-33mRNA水平平均升高2.73±1.34倍，两组比较有统计学差异（p=0.045）。说明从mRNA水平看，MRL/lpr小鼠肾组织上调了IL-33的表达。MRL/lpr组较C57组表达IL-33蛋白水平显著升高（灰度比值为0.558±0.094vs0.034±0.002），C57组IL-33表达量极少，两组比较有统计学差异（p=0.0005）。说明从蛋白水平看，MRL/lpr小鼠肾组织上调了IL-33的表达。 5、MRL/lpr小鼠肾组织IL-33蛋白与尿蛋白、血清ds-DNA的相关性分析 spearman相关系数分析显示MRL/lpr小鼠肾组织IL-33灰度比值变化与半定量尿蛋白变化呈明显正相关（r2=0.72，p=0.037）。而与血清ds-DNA半定量水平则无明显相关（r2=0.386，p=0.215），但也出现正相关趋势。 6、IL-33在小鼠肾组织的表达来源细胞 MRL/lpr在肾小球基底膜区细胞有较多IL-33表达，肾间质少见IL-33表达。C57只有极个别肾小球基底膜区细胞表达IL-33，较MRL/lpr显著减少。进一步行免疫荧光双染检测（IL-33+VWF）发现，IL-33表达在肾小球内皮细胞。 7、LN患者与健康体检者外周血细胞ST2受体的表达与健康对照组相比，ST2受体高表达于LN患者外周血CD4+T细胞及CD14+单核细胞表面，2组有显著差异。结论： 1、IL-33高表达于MRL/lpr小鼠肾组织，并且表达水平与可反应肾损害程度的尿蛋白水平呈正相关。 2、IL-33在肾组织的表达来源细胞是肾小球内皮细胞。 3、LN患者外周血单核细胞和CD4T细胞表面高表达ST2受体，提示IL-33可能通过介导外周血单核细胞和CD4T细胞趋化浸润至肾脏组织而导致肾脏炎症损伤。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R593.242

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