热激对大鼠睾丸生精细胞的凋亡作用与机制研究

发布时间：2018-04-11 01:30

本文选题：Hsp70 + Hsp90　；参考：《北京中医药大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究目的：WHO报道,发达国家育龄夫妇中不孕不育的发生率为15%,其中男性原因占到50%。男性不育可由全身内分泌疾病引起,也可因生精障碍导致无精、少精或死精,还可因在生殖管道中运输障碍而致,其中生精障碍是主要原因。本课题试图较深入地研究睾丸热激诱导生精障碍的分子机制,热休克蛋白在生精细胞凋亡过程中的保护机制,以及五子衍宗丸对生精障碍的作用及机制,阐明其分子靶点,拓宽中药方剂在生精障碍所致男性不育的临床应用范围。研究方法：实验一：66只雄性大鼠随机分组为正常组(6只)、10 min热激组(30只)、20 min热激组(30只),43℃(正常组22℃)水浴热激。10min与20 min热激组分别在热激后0.5h、2h、6h、24h、48h取材进行指标检测,HE观察形态变化,Real time PCR检测Hsp70、Hsp90、Hsp105、Bax、Bcl-2 mRNA的表达。实验二：36只雄性大鼠随机分组为正常组、热激组,43℃(正常组22℃)水浴热激20min。热激组分别在热激后0.5 h、2 h、6 h、24 h、48 h取材进行指标检测,HE观察形态变化,TUNEL检测生精细胞凋亡信号的变化,Real time PCR检测Hsp70、 Hsp90、Hsp105、Bax、Bcl-2 mRNA的表达,Western blot检测活化caspase-3的表达。实验三：102只雄性大鼠随机分组为正常组(24只)、模型组(24只),低、中、高剂量组(各18只),43℃(正常组22℃)水浴热激20 min。分别在0天(造模当天)、给药后5天、10天、15天取血取材进行指标检测,放射免疫法检测血清FSH、LH、T的变化,HE观察形态变化,Real time PCR检测Hsp70、Hsp90、Hsp105、Bax、 Bcl-2 mRNA的表达。研究结果：实验一：43℃、10 min睾丸热激后,各组的生精上皮没有发生明显变化。而43℃、20 min热激模型6h后,生精上皮已发生明显变化,上皮排列紊乱,生精细胞已经开始脱落,甚至形成了多核巨细胞；热激后24 h,生精上皮变薄,生精细胞彼此分离并脱落造成生精上皮有很多不规则的空隙,管腔内缺失精母细胞和圆形精子细胞；热激后48 h,曲细精管形态进一步紊乱,并形成了多个多核巨大细胞和变性空泡细胞。43℃热激后0.5 h时,20 min热激模型Hsp70 mRNA的表达量大约是10min热激模型组的3倍,而2h时达到了3.5倍,热激后6h时,10 min热激模型组Hsp70 mRNA水平已恢复到正常水平,而20 min热激模型组依然保持高表达量。同样,Hsp90、Hsp105、Bax、Bcl-2 mRNA, Bcl-2/Bax在20 min热激模型组的表达变化幅度比10 min热激模型组大。实验二：43℃、20 min睾丸热激后生精细胞逐渐脱落甚至缺失,TUNEL检测凋亡信号发现,在热激后0.5 h、2 h时曲细精管没有明显变化,而6 h后曲细精管中阳性细胞数明显增多,24h时表现最为严重,48 h后阳性细胞数反而较少,这与HE检测的形态,生精细胞严重脱落缺失变化一致。热激后Hsp70 mRNA的表达迅速上调,0.5 h组、2 h组与正常组之间有统计学差异(P0.05)；热激后Hsp90 mRNA的表达下调,各热激组与正常组之间均有统计学差异(P0.05)；而Hsp105 mRNA的表达是逐渐上调,在热激后6 h时达到最高,且与正常组之间有统计学差异(P0.05)；各热激组Bax的表达与正常组相比均无统计学差异(P0.05), Bcl-2 mRNA的表达在热激0.5 h、2 h、6 h组与正常组之间比较均有统计学差异(P0.05).更有趣的是,热激后Bcl-2/Bax逐渐升高,且热激0.5 h、2 h、6 h组与正常组之间相比均有统计学差异(P0.05)。活化caspase-3在2 h时表达最少,与正常组之间有统计学差异(P0.05)。实验三：FSH、LH、T的各亚组之间均没有统计学差异(P0.05)。正常组的睾丸组织形态,生精上皮完整,各级生精细胞及精子细胞排列有序；造模当天模型组的各级生精细胞松散,胞间的连接组织有些消失。热激后5天时,各热激组均出现了变性空泡细胞和多核巨大细胞,间质细胞稍有增厚；五子衍宗丸各给药组与模型组在形态上没有明显差异。热激后10天时,各热激组精母细胞严重缺失,生精上皮薄且紊乱,各级生精细胞层次消失,甚至有明显空腔现象,间质细胞明显增厚；五子衍宗丸各给药组与模型组在形态上没有明显差异。热激后15天时,曲细精管中生精上皮严重破坏,管腔中生精细胞枯竭；五子衍宗丸各给药组与模型组在形态上没有明显差异。Hsp70 mRNA的表达在睾丸热激后各组之间均没有统计学差异(P0.05)。睾丸热激后5天时,模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组Hsp90 mRNA的表达量均比正常组降低,且与正常组之间均有统计学差异(P0.05)；热激后5天、10天模型组的Hsp90 mRNA表达与热激当天模型组之间均有统计学差异(P0.05)；其他两组之间均没有统计学差异(P0.05)。Hsp105 mRNA的表达在睾丸热激后5天的模型组、低剂量组、高剂量组与正常组之间有统计学差异(P0.05)；其他两组之间均没有统计学差异(P0.05)。Bax mRNA的表达在睾丸热激后5天的中剂量组与正常组之间有统计学差异(P0.05),其表达在热激后10天、15天模型组与热激当天模型组之间均有统计学差异(P0.05)；其他两组之间均没有统计学差异(P0.05)。Bc1-2 mRNA的表达在睾丸热激后10天的模型组与正常组之间有统计学差异(P0.05),其表达在热激后10天、15天模型组与热激当天模型组之间均有统计学差异(P0.05)；其他两组之间均没有统计学差异(P0.05)。Bc1-2/Bax在睾丸热激后10天、15天模型组与热激当天模型组之间均有统计学差异(P0.05)；其他两组之间均没有统计学差异(P0.05)。研究结论：实验一：大鼠睾丸43℃、20 min水浴热激能够成功建立一种生精障碍模型。实验二：大鼠睾丸43℃、20min水浴热激后,Hsp70早期的高表达,Hsp90表达下调,Hsp105表达逐渐增高,有可能通过上调Bc1-2/Bax、下调活化caspase-3避免生精细胞的凋亡从而起到保护作用。实验三：大鼠睾丸43℃、20min水浴热激后,灌胃给予五子衍宗丸5天、10天、15天,均不能逆转生精细胞Hsp70、Hsp90、Hsp105的表达,也不能抑制生精细胞的凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R698

【参考文献】