一、PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 二、HepaCAM对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨

发布时间：2018-04-21 08:47

  本文选题：PLCε基因 + 原核表达　； 参考：《重庆医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的： 1.构建PLCε原核表达系统。表达、分离纯化PLCε蛋白并鉴定。 2.制备兔抗PLCε蛋白抗血清，进一步分离纯化验证其特异性，并初步在膀胱癌中应用。 方法： 1.应用RT-PCR从人膀胱癌细胞cDNA中克隆出氨基端PLCε基因，将此氨基端PLCε片段连接至pGEX-6P-1原核表达载体上，构建原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε。 2.将原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达GST-PLCε重组蛋白，通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白，鉴定所纯化的重组蛋白。 3．将纯化的GST-PLCε重组蛋白免疫家兔，制备家兔抗PLCε的抗血清，经蛋白A抗体纯化系统分离纯化抗血清，ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。 4.利用制备的PLCε抗血清包被ELISA板，制备快速PLCε蛋白血清检测ELISA试剂盒，检测30例膀胱癌患者与6例正常人血清中PLCε蛋白的表达情况，初步探索PLCε抗血清在膀胱癌中应用。 结果： 1．经RT-PCR、基因重组、酶切及测序验证原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε构建成功，通过GST亲和层析系统分离纯化，得到GST-PLCε重组蛋白。 2.将纯化后的GST-PLCε重组蛋白免疫家兔，经纯化获得抗血清；ELISA效价1:16000以上；Western blot结果显示，该抗血清与原核表达的GST-PLCε重组蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。 3.制备的抗血清包被的ELISA可以检测到血清中PLCε蛋白的表达，膀胱癌患者血清中PLCε为5.62±2.79ng/ml高于正常对照组2.53±0.42ng/ml（P＜0.05）,差异具有统计学意义。 结论： 成功构建PGEX-6P-1/PLCε原核表达系统，纯化获得了较高纯度的GST-PLCε重组蛋白，并以重组蛋白为免疫原，制备了兔抗PLCε的抗血清，初步用于膀胱癌的血清学检测。PLCε的抗血清的获得为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础，同时也为开发快速检测膀胱癌诊断试剂盒提供了实验数据。 目的： 1.探讨HepaCAM基因在前列腺组织及细胞株中的表达，分析其表达与各临床病理参数的相关性。 2.利用腺病毒载体，过表达HepaCAM基因，，检测其对人前列腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移等生物学功能的影响及机制探讨。 方法： 1.应用RT-PCR和Western blot等技术，检测前列腺细胞株RWPE-1,LNCap, DU145及PC3中HepaCAM基因的表达。应用IHC技术检测75例前列腺组织中HepaCAM蛋白的表达情况，统计学分析其表达与各临床病理参数的相关性。 2.应用WST-8试验、FCM、划痕试验及Transwell等实验技术检测HepaCAM对前列癌LNCap, DU145和PC3细胞株增殖、凋亡、侵袭和转移的影响。应用Western blot检测HepaCAM、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9和GAPDH等相关蛋白水平的表达。 3.应用细胞免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术，检测过表达HepaCAM后前列腺癌LNCap细胞中AR的mRNA和蛋白水平的影响。应用Western blot和ELISA技术检测HepaCAM对其胞质及分泌型PSA的影响。应用EGF处理细胞后，Western blot检测HepaCAM对癌细胞P-ERK及t-ERK等蛋白表达的影响。 结果： 1. HepaCAM基因在LNCap, DU145和PC3细胞中表达缺失，在前列腺癌组织中的表达与BPH及正常前列腺组织相比显著降低，且与前列腺癌各临床参数间均无相关性。 2. HepaCAM基因能够抑制前列腺癌LNCap, DU145和PC3细胞的增殖，诱导细胞凋亡，降低癌细胞侵袭及转移。体外过表达HepaCAM后能够降低Bcl-2、MMP2和MMP9的表达，增加Bax的表达水平。 3.细胞免疫荧光及Western blot结果显示，HepaCAM可以抑制前列腺癌LNCap的AR核转移，降低AR的表达。Western blot和ELISA检测PSA表达明显下降。HepaCAM可以阻滞ERK的磷酸化表达水平。 结论: 在前列腺癌中HepaCAM低表达，过表达HepaCAM可以抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭与转移，诱导细胞凋亡。相关分子机制可能是HepaCAM抑制前列腺癌AR的核转位和ERK磷酸化来实现的。因此，HepaCAM基因缺失对临床判断前列腺癌的发生发展有指导意义，为肿瘤的生物治疗提供新的分子靶点。
[Abstract]:Objective:
1. construction of prokaryotic expression system of PLC epsilon. Expression, isolation and purification of PLC epsilon protein and identification.
2. preparation of Rabbit anti PLC epsilon protein antiserum, further separation and purification to verify its specificity, and preliminary application in bladder cancer.
Method锛

本文编号：1781724