miRNA-20a靶向Atg7影响的自噬对造影剂诱导的急性肾损伤的机制研究及新的急性肾损伤危险因素探讨

发布时间：2018-05-26 17:08

本文选题：造影剂 + 急性肾损伤　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景(1)造影剂诱导急性肾损伤的发生风险不断上升,且危害大。目前临床实践中已广泛使用造影剂相关的检查,如增强CT和心导管诊疗术。造影剂所致的急性肾损伤(Contrast-Induced acute kidney injury,CI-AKI)发生率逐年上升,达1%-5%,而对于高危人群,其发生率达30-50%。发生CI-AKI后,患者的住院时间延长,医疗费用增加,甚至远期不良心肾事件发生率增高。因此我国冠脉介入诊疗术病例会继续增长,CI-AKI风险仍在不断增加。(2)目前尚无CI-AKI防治的有效治疗措施。目前对于CI-AKI的预防除了围手术期给予充分生理盐水水化和手术过程中限制造影剂剂量的使用外,尚无更为有效的防治措施。因此,如何有效早期筛查发生CI-AKI的高危人群,从而加强造影剂接触术后血清肌酐检测等措施,成为CI-AKI防治的重点。早期筛查高危人群,不仅可以对高危人群给予必要的监测,同时可以减少对低危患者的过度治疗,导致医疗资源的浪费。(3)发现新的CI-AKI危险因素,有利于筛查CI-AKI高危人群。虽然一些危险因素与CI-AKI密切相关,如慢性肾病和糖尿病等,然而找出一个新的危险因素从而有效地提高CI-AKI高危人群的识别率,仍然是值得研究的问题。我们前期的研究发现,与炎症或内皮功能不全相关的指标如高敏C反应蛋白、N端脑钠利肽等血清标志物,与CI-AKI的发生密切相关。从而表明,炎症、内皮功能不全亦可能参与CI-AKI的发生。而作为住院期间常规且必须检测的指标一低密度脂蛋白(LDL-C),已被证实与不良心脑血管事件明显相关,且与炎症反应、内皮功能不全等相关。然而,目前关于LDL-C与CI-AKI关系的相关研究尚缺乏,两者关系仍不确定。因此本研究拟通过前瞻性观察研究的临床样本,探讨LDL-C与PCI术后CI-AKI的相关性。(4)CI-AKI发生的病理生理机制仍未完全清楚,而新的机制有利于新的防治方法研究。另外,目前CI-AKI的发病机制仍未完全清楚。而对于CI-AKI机制的进一步探讨,将有利于CI-AKI防治措施的研发。既往关于CI-AKI的基础研究大部分基于相同的CI-AKI动物模型。通过联合脱水,非甾体类药如吲哚美辛和高渗造影剂如泛影葡胺,建立大鼠的CI-AKI模型。然而,临床实践中,相关指南已明确建议术前停用肾毒性药物和使用等渗或者低渗造影剂,所以,患者发生CI-AKI的机制也往往与非甾体类药物和高渗造影剂导致的CI-AKI机制不同。所以,建立与临床实践中患者发生CI-AKI相符的动物模型,将更有利于CI-AKI的病理生理机制研究。(5) Micro-RNA与急性肾损伤的相关性。由于缺乏肾脏早期损伤预测的指标,所以近年来研究较为热门的生物学标志物涉及miRNA等。其中miRNA组织特异性强、容易放大信号通路、能够承受反复冻融并以非常稳定的形式存在于血液和其他体液中,使其已成为反映肾脏疾病的新型生物学标志物。Godlwin J等通过建立单侧肾动脉缺血30分钟再灌注不同天数的小鼠肾脏缺血再灌注(ischemic reperfusion,I/R)导致的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)模型,研究AKI后miRNA的表达谱。研究发现I/R后570种miRNAs中的9个miRNAs(miR-21,miR-20a等)与对照组有显著性差异。其中miR-21和miR-20a水平在I/R后快速增加并可持续7天。然而,不同原因导致AKI的具体机制并不完全相同,miRNAs表达谱的水平亦可能不完全相同。然而,目前尚无研究探讨miRNAs与CI-AKI之间的关系。研究CI-AKI模型中miRNAs的表达变化及机制,对于CIAKI的防治显得尤为重要。(6)自噬与急性肾损伤的相关性自噬是细胞在自噬相关基因(autophagy-related gene, Atg)的调控下利用溶酶体降解自身变性、衰老及凋亡的细胞器和大分子物质来维持细胞内环境稳定的高度保守降解过程。自噬在肿瘤领域研究广泛,已证实自噬的异常可导致或加重肿瘤的进展。然而,在肾脏疾病中尤其是CI-AKI的相关研究较少。近年来,自噬在肾脏疾病特别是AKI中的作用逐渐受到关注。在顺铂诱导的大鼠AKI模型中可观察到肾皮质和外髓部自噬调控蛋白的增多。应用自噬抑制剂氯喹后,可显著增加肾小管细胞凋亡数目,提高血尿素氮和肌酐水平；而加用雷帕霉素上调自噬水平后,相应指标均有所下降。此研究结果与Periyasamy-Thandava等一致,都证实了自噬对近端小管的保护作用。然而,亦有研究发现自噬对近端小管细胞存在损伤作用。尽管如此,目前更多的研究支持自噬对AKI的保护作用。然而,目前并未发现有研究探讨通过调节自噬的表达水平,观察自噬对CI-AKI模型中AKI的损伤程度的影响。(7) Micro-RNA,自噬与急性肾损伤的相关性Pickering MT等在细胞水平将miRNA-20a阻断,可检测到众多不成熟的E2F1及断裂的双联DNA,表明miRNA-20a在调控E2F1的转录功能上发挥重要作用。以上研究发现提示miRNA-20a可通过E2F1参与调节自噬水平。因此,我们推测在既往AKI研究中提示的早期即可迅速升高的miRNA-20a,同样可通过相应分子网络调控自噬水平,影响CI-AKI的发生发展。Atg7是具有泛素E1样酶活性的自噬相关基因,在自噬延伸阶段催化Atg12活化,之后转运至E2样酶Atg10,进而与Atg5、Atg16L结合,形成三元复合物Atg12-Atg 5-Atg16L。此复合物结合前自噬泡外膜,促进自噬泡的伸展延伸。同时Atg7也参与LC3-I活化,促进LC3-I与磷脂酰乙醇胺(PE)结合形成自噬标记分子LC3-Ⅱ。因此,Atg7是自噬延伸起始阶段中不可或缺的重要自噬相关基因(如下图)。为进一步探究Atg7与miRNAs调控CI-AKI的机制,我们通过生物信息软件分析提示miRNA-20a对Atg7可能存在靶向调控作用。因此,我们推测CI-AKI中,miRNA-20a可能通过调控靶基因Atg7从而调节自噬的表达水平影响AKI。基于以上背景,本文拟从以下四个部分进一步围绕CI-AKI的发生机制及临床实践中CI-AKI的防治进行系列研究：(1)建立与临床患者发生CI-AKI相似的动物模型,基于低渗造影剂(碘普罗胺,优维显)的CI-AKI模型；(2)在新的CI-AKI模型中,利用基因芯片技术探讨对照组和CI-AKI组中miRNA的表达谱差异,同时验证差异的miRNA-20a(假设为miRNA-20a)与CI-AKI的相关性；(3)探讨自噬在CI-AKI的表达水平及作用及miRNA-20a,靶基因ATG7、自噬和CI-AKI三者的相关性；初步证明miRNA-20a可以靶向调节ATG7,从而调节自噬在CI-AKI中的表达水平;(4)通过前瞻性观察研究进一步探讨CI-AKI在非选择性人群中的发生率及CI-AKI对院内不良事件的影响,重点探讨低密度脂蛋白是否为CI-AKI的新的危险因素,从而为CI-AKI的筛查增加准确性。第一章建立新型的以低渗造影剂诱导的急性肾损伤的动物模型研究目的建立新型的低渗造影剂诱导的急性肾损伤(CI-AKI)动物模型,以利于后期CI-AKI的病理机制研究研究方法成年SD雄性大鼠30只,体重200-220g,正常饲养7天适应环境,不限进食、饮水；7天后随机分为5组,每组各6只,分别进行称重。5组分别为：(1)生理盐水(NS)+NS组；(2)NS+造影剂(CM)15ml组； (3)呋塞米(FM)+NS组；(4) FM+CM10ml组;(5) FM+CM15ml组；所有组禁水6h后,第二次测量体重,并以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg),眼眶静脉丛取血0.8-1ml,置于干冰中；然后,组2、组4、组5分别从尾静脉缓慢注射碘普罗胺,时间约10 min；其他两组分别注射相同量的生理盐水作为对照。上述5组大鼠尾静脉注射操作完毕后,直接不限进水、进食,24 h后第三次测量体重,及留取血标本检测血清肌酐值及胱抑素C；同时取肾脏组织做病理染色及观察肾脏组织的超微结构。研究结果呋塞米+造影剂15ml组干预后血清肌酐水平明显高于干预前(158.7±14.48比32.9±4.57 μmol/L,p0.001)。而其他几组干预后的血清肌酐水平比干预前变化不大。另外,呋塞米+造影剂15ml组,干预后血清胱抑素C水平亦明显高于干预前(0.18±0.05 mg/L比0.08±0.03,p0.001)。然而,呋塞米+生理盐水组干预前后的血清胱抑素C水平变化不大。而且,在这些组中,只有呋塞米+造影剂15ml组的血清肌酐或者胱抑素C的变化值达到了CI-AKI的诊断标准。呋塞米+造影剂15ml组(CI-AKI组)大鼠肾脏组织HE染色结果显示肾小管排列紊乱,管腔变小甚至闭塞,可见细胞核固缩、裂解。而FM+NS组(对照组)HE染色结果提示肾脏各结构基本正常。另外,肾脏组织的透射电镜超微结构显示,CI-AK组肾小管基底膜增厚,线粒体肿胀,可见空泡,界脊排列紊乱,甚至消失；同时,管腔面的微绒毛缩短,甚至大量脱落,而对照组肾脏各结构基本正常。研究结论本研究通过联合速尿和脱水,建立了与临床实践中患者发生CI-AKI相对吻合的,以低渗造影剂-碘普罗胺诱导的急性肾损伤SD大鼠模型,该模型简单易行,相对稳定可靠,可用于后续CI-AKI发病机制的进一步研究。第二章探讨CI-AKI模型中miRNA的表达谱,同时验证差异的miRNA-20a与CI-AKI的相关性研究目的探讨CI-AKI模型中miRNA的表达谱,同时验证差异的miRNA-20a与CI-AKI的相关性。研究方法通过前期的CI-AKI的建模方法,建立CI-AKI组和对照组即：呋塞米+造影剂15ml组和呋塞米+生理盐水组；给予SD大鼠尾静脉注射造影剂或者生理盐水24 h后以10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,眼眶静脉丛取血0.8-1 ml;同时取肾脏组织以液氮保存。取两组SD大鼠肾脏组织进行基因芯片分析差异miRNA表达谱；同时,对差异倍数较大的(前20位)进行靶基因网络分析,预测与关键自噬基因相关的miRNA,然后对该miRNA进行q-PCR验证。研究结果通过基因芯片筛查发现,CI-AKI组和对照组两组间差异(2倍以上差异)的miRNA总共为230个,其中上调的为108个,下调的为122个。上调的miRNA包括miRNA148a-3p、miRNA25a-3p和miRNA20a-5p等。下调的miRNA包括miRNA3596d、miRNA3584-3p和miRNA340-3p等。经过靶基因网络功能分析及结合既往报道过的与自噬相关的明确的关键靶基因,挑选出下一步研究的目标miRNA为miRNA20a,同时对CI-AKI组和对照组两组的肾脏组织及外周血清进行q-PCR验证得出,CI-AKI组miRNA20a的表达水平无论是肾脏组织还是外周血清均高于对照组。研究结论基因芯片分析结果提示,CI-AKI组与非CI-AKI组存在多种表达水平升高或者降低的miRNA,弥补了CI-AKI领域miRNA表达谱的空白：同时,为进一步研究miRNA与自噬在CI-AKI发生发展中的作用,研究挑选miRNA-20a作为研究的miRNA,并经过进一步验证结果发现,CI-AKI组miRNA-20a的表达水平高于非CI-AKI组,为后续研究提供依据第三章miRNA-20a调控靶基因Atg7影响自噬调节造影剂诱导急性肾损伤的机制研究研究目的初步证明miRNA-20a可以调控靶基因Atg7影响自噬从而调节造影剂诱导的急性肾损伤研究方法基于前面的SD大鼠的CI-AKI模型和基因筛查挑选的miRNA-20a,通过TargetScan等软件对miRNA-20a可能的靶基因进行预测分析,找出与自噬相关的关键基因。利用双荧光素酶报告方法验证miRNA-20a与预测基因的靶向结合关系；然后利用q-PCR检测自噬相关基因、western-blot检测自噬相关蛋白、免疫组化和透射电镜观察自噬小体数量的方法分析SD大鼠CI-AKI组和对照组自噬的表达情况；最后通过使用miRNA20a抑制剂下调miRNA-20a后观察自噬的表达情况,具体分为以下四组(1)CI-AKI组；(2)对照组;(3)CI-AKI+antagomir miRNA-20a;(4)CI-AKI+空白对照。然后通过外周血血清肌酐的改变和肾脏组织HE染色评估肾脏损伤情况,同时,通过上述提及的方法如western-blot观察自噬水平的改变及其对肾脏损伤的作用。研究结果通过TargetScan和MicroRNA.ORG数据库分析得出miRNA-20a与自噬相关的靶基因,且既往研究已经证实该基因为自噬关键相关基因为Atg7。利用双荧光素酶报告方法得出miRNA20a可以靶向结合Atg7。wester-blot证实CI-AKI组的自噬相关蛋白Belin-1表达高于对照组；q-PCR检测发现自噬关基因Atg7表达水平高于对照组；同时,透射电镜观察得出,CI-AKI组的自噬表达量高于对照组。尽管CI-AKI组自噬的表达水平增高,但此时还不能反应自噬在CI-AKI中的作用。我们通过下调miRNA-20a的水平,通过q-PCR、wester-blot、免疫组化和透射电镜方法证实,此时CI-AKI+antagomir miRNA-20a的自噬表达水平比CI-AKI+空白对照更高,而外周血清肌酐水平显示该组的肾功能下降比CI-AKI+空白对照明显,同时HE染色显示,自噬表达水平高的SD大鼠肾脏组织损伤较轻,但高于对照组。研究结论通过前期建立的新型低渗造影剂诱导的急性肾损伤模型,证实自噬在此CI-AKI模型的表达水平；同时,研究发现miRNA20a可以靶向结合Atg7；干预miRNA20a可以通过调节Atg7从而影响大鼠肾脏组织自噬的表达水平,进而影响造影剂所致急性肾脏损伤的程度。第四章经皮冠脉介入治疗后造影剂所致急性肾损伤的新危险因素探讨研究目的探讨低密度脂蛋白(LDL-C)是否为经皮冠脉介入治疗(PCI)后造影剂所致急性肾损伤(CI-AKI)的新危险因素研究方法连续收集2010年1月至2012年9月于广东省人民医院住院拟行PCI的患者3236例。比较不同LDL-C水平四分位间的基线特点,同时比较发生与未发生CI-AKI患者的临床特征及院内不良事件。利用单因素和多因素分析发现CI-AKI的独立危险因素。CI-AKI定义为造影剂暴露后48-72h内,血清肌酐绝对值升高≥44.2umol/L或较基础值升高≥25%,并排除其他原因所致的肾功能损害。研究结果本研究最终连续性入选3236例行PCI术的患者。所有入选患者的平均年龄63.3±11.0岁,平均LDL-C水平为2.7±0.9 mmol/L,平均肾小球滤过率为81.4±25.3mL/min/1.73m2,平均Mehran评分为4.5±3.8。3236例患者中,338例发生CI-AKI,发生率达10.4%。此外,CI-AKI组中患者全因死亡率(4.4%比0.5%,P0.001)及院内主要复合不良事件均高于非CI-AKI组。LDL-C水平四分位值为Q1 (2.04 mmol/L), Q2 (2.04-2.61 mmol/L), Q3 (2.61-3.21 mmol/L) and Q4 (3.21 mmol/L)。LDL四分位四组间CI-AKI的发生率及院内复合不良事件的发生率,随着LDL水平的增加呈现增加的趋势,且差异有统计学意义(8.9%,9.9%,10.5%,12.6%, p=0.001;和5.0%,5.2%,6.1%,8.1%,10=0.007)。单因素回归分析结果显示,LDL-C(每增加1单位)为CI-AKI发生的危险因素(OR=1.25,95% CI,1.11-1.39,p0.001),每增加1单位,CI-AKI的发生风险增加25%。多因素分析显示,校正混杂因素后,LDL-C仍是CI-AKI的独立危险因素(OR=1.23,95% CI,1.04-1.45, p=0.014).另外,慢性心力衰竭、低蛋白血症和急诊冠脉介入术是CI-AKI其他的独立危险因素。研究结论本研究发现,对于非选择性人群,行PCI术后CI-AKI的发生率高,达10.4%,且发生CI-AKI后院内不良事件如院内全因死亡和院内复合不良事件发生率增高；同时,本研究初次报道LDL作为常用的实验室检测指标,与CI-AKI的发生相关,成为评估CI-AKI发生的新的危险因素,有望加入目前现有的CI-AKI评分,提高筛查CI-AKI高危人群的能力；另外,研究发现,除LDL外,慢性心功能不全、急诊冠脉介入术和低蛋白血症亦与CI-AKI的发生相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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