去势抵抗性前列腺癌中雄激素受体剪切变异体全基因组结合位点及其基因标记的初步分析

发布时间：2018-05-27 19:17

  本文选题：前列腺癌 + 去势抵抗　； 参考：《吉林大学》2014年博士论文

【摘要】：雄激素剥夺治疗（androgen deprived therapy, ADT）是不宜行手术治疗的或晚期前列腺癌的首选治疗手段。雄激素通过与雄激素受体（androgen receptor, AR）结合发挥作用，促进前列腺肿瘤的发生和进展。ADT治疗即是针对这条雄激素受体信号途径的不同环节发挥作用的。但是，尽管ADT治疗在初期可以缓解前列腺癌的进展，大多数肿瘤最终都会由雄激素依赖型进展为雄激素非依赖型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC），对治疗产生抵抗，也称去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）。 AR是核受体超家族的一员，全长雄激素受体（AR-FL）共包含四个结构域，即包含转录活性区的N端域（N-terminal domain, NTD），DNA结合域（DNA-binding domain, DBD），铰链区以及配体结合域（ligand-binding domain，LBD）。在去雄激素条件下，AR位于细胞质中并与热休克蛋白90（heat shockproteins, HSP90）结合。当雄激素进入细胞后，与AR的LBD结构域结合，促使AR与HSP解离，并发生构象改变，形成同源二聚体，并暴露出铰链区的核定位信号（nuclear localization signal, NLS），介导AR进入细胞核中。在核中，AR同源二聚体识别雄激素反应元件（androgen response elements, ARE）并与之结合，同时招募一般性转录因子、RNA聚合酶Ⅱ及AR共调节因子形成转录复合物，引起特定靶基因的转录激活或抑制。 雄激素受体剪切变异体（androgen receptor splice variants, AR-Vs）是一种截短的AR-FL。这些剪切变异体所编码的蛋白质同AR-FL一样在N-端都具有NTD和DBD结构域，但是在C-端缺少LBD结构域，代之以不同的隐藏外显子所编码的氨基酸结构。由于缺少LBD结构域，雄激素无法与AR-Vs结合，也正因为这样，AR-Vs对于针对AR信号途径的传统ADT治疗没有反应。同时，由于AR-Vs仍保留有DBD结构域，仍能与基因组DNA结合，调控下游靶基因的表达。因此，AR-Vs可能是ADT抵抗和CRPC进展的重要机制之一。 虽然现有研究已证实AR-Vs具有雄激素非依赖性的结构性活性，但是其在功能上是否需要依赖AR-FL还存在争议。同时，AR-Vs与基因组DNA结合后，是否调节了特异性的靶基因报道结果也不尽相同。最后，AR-Vs所调节的靶基因与前列腺癌的进展、特别是CRPC的相关性如何，，有没有可能对判断预后和诊断产生帮助，也未见报道。因此，本研究的主要目的如下：（1）评估前列腺癌细胞系中AR-Vs表达量及转录活性，确定有代表性的细胞模型；（2）鉴定AR-Vs的全基因组DNA结合位点，并对其是否需要依赖AR-FL进行评估；（3）以CRPC的细胞模型为基础对AR-Vs的基因表达谱进行分析，找出特异性的基因标记；（4）就鉴定出的AR-Vs基因标记在前列腺组织标本中的表达情况进行分析，阐明临床意义。 本研究首先应用实时荧光定量PCR方法对一系列雄激素依赖性和雄激素非依赖性人类前列腺癌细胞中的AR-Vs mRNA水平进行绝对定量。结果显示，在雄激素非依赖性的22Rv1细胞中，除了AR-FL外，四种AR-Vs均有高表达。并且，22Rv1细胞中的AR-Vs表现出雄激素非依赖性的结构性转录活性。由于AR-Vs在22Rv1细胞中表现出与临床标本近似的异质性，因此可以作为理想的CRPC细胞模型。 其次，以22Rv1细胞为研究对象，对AR-Vs全基因组结合位点进行鉴定。通过RNA干扰方法建立三个细胞组22Rv1-ARFL+/ARVs+、22Rv1-ARFL-/ARVs+和22Rv1-ARFL-/ARVs-，使用靶向AR N-端的抗体进行染色体免疫共沉淀-测序（ChIP-seq）。定性分析22Rv1-ARFL+/ARVs+、22Rv1-ARFL-/ARVs+两组细胞中AR的全基因组结合情况显示，大约75%的AR结合位点重合；定量分析显示，AR全基因组结合位点在两组细胞中的峰值强度是相似的。这提示，AR-Vs在去雄激素条件下，能够与基因组DNA结合，并且不受AR-FL存在的影响。 再次，对22Rv1细胞中AR-Vs的基因表达谱进行分析。仍采用相同实验设计，通过基因芯片方法鉴定各组的基因表达谱情况，然后分析获得在去雄激素培养条件下受所有AR亚型调节的基因和受AR-FL调节的基因。通过文氏图比较两组差异表达基因，从中得到受AR-Vs特异性调控的基因，选取其中倍数变化明显的作为AR-Vs基因标记。同时，将前述实验所获得的全基因组DNA结合位点数据同基因表达谱数据进行整合分析，发现所鉴别的AR-Vs与基因组DNA结合后，很有可能直接调控一部分AR-Vs靶基因。 最后，探讨所获得的AR-Vs基因标记与临床组织标本的相关性。选取两个前列腺癌临床标本数据库进行研究，进行聚类分析发现，AR-Vs基因标记不仅能够很好地将局限性前列腺癌和转移性CRPC分离开来，还能将良性前列腺组织和恶性前列腺组织明显的分清。进一步比较发现，部分AR-Vs基因标记与Gleason分型/淋巴结转移存在着正相关或负相关，与雄激素剥夺治疗后出现的生化复发也有相关性。这些发现提示，AR-Vs基因标记与CRPC及前列腺癌进展存在相关性。 综上所述，本研究通过比较多种AR-Vs在各前列腺癌细胞中的表达情况，选择22Rv1作为AR-Vs研究的CRPC细胞模型。首次对AR-Vs的全基因组结合位点进行了分析，证实在去雄激素培养的条件下，AR-Vs能够与基因组DNA结合，并不受AR-FL存在的影响。同时，AR-Vs基因表达谱分析显示，AR-Vs能够调节一部分特异性的基因，并可能受AR-Vs与DNA结合的直接调控。从中选择的AR-Vs基因标记也被证明与CRPC及前列腺癌进展存在相关性，进一步明确了AR-Vs在CRPC中的潜在作用，为发现前列腺癌新的肿瘤生物标志物和新的治疗靶点提供基础。
[Abstract]:Androgen deprivation therapy ( ADT ) is the preferred treatment for the treatment of prostate cancer or advanced prostate cancer . androgen receptor ( AR ) plays a role in promoting the development and progression of prostate cancer . ADT therapy is a different link to androgen receptor signaling pathway . However , although ADT therapy can alleviate the progression of prostate cancer at an early stage , most tumors eventually develop androgen - dependent progression into androgen - independent prostate cancer ( AIPC ) , which is also known as castration - resistant prostate cancer ( AIPC ) .

AR is a member of the nuclear receptor superfamily , and the full - length androgen receptor ( AR - FL ) contains four domains , i.e . , the N - terminal domain ( NTD ) , the DNA - binding domain , the dbd - domain , the hinge region and the ligand - binding domain ( LBD ) containing the transcription active region . When androgen enters the cell , the AR is combined with the LBD domain of the AR to promote the dissociation of the AR with HSP and the conformation change to form the homologous dimer . In the core , the AR homologous dimer binds to the androgen response element ( ARE ) and binds to it . In the core , the AR homologous dimer recognizes androgen response elements ( ARE ) and forms a transcription complex , which causes transcriptional activation or inhibition of a specific target gene .

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本文编号：1943435