【摘要】：肾间质纤维化是各种慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)发展到终末尿毒症期的共同途径，它以过量细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。既往研究表明，由成纤维细胞分化形成的肌成纤维细胞是分泌ECM的主要来源，而肾小管上皮细胞重塑可以导致细胞完整性破坏并出现肌成纤维细胞表型，同样促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原等基质蛋白合成。因此，抑制成纤维细胞增生、分化以及肾小管上皮细胞重塑是减少肌成纤维细胞数量和ECM合成的重要途径，对相关机制和干预措施的探讨将为防治肾间质纤维化提供新策略和新靶点。 成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor-2, FGF2)参与多种细胞增生和分化，在肾脏发育过程中也发挥着重要作用，在肾小球内皮细胞，系膜细胞，肾小管上皮细胞和肾间质都可以检测到FGF2的表达。近年研究发现，FGF2与肾间质纤维化的发生和发展可能密切相关，它可以诱导肾小管上皮细胞出现肌成纤维细胞表型，诱导肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(vimentin)表达增高，并释放基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2，同时抑制上皮细胞标志物细胞角蛋白(cytokeratin)和E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达。不仅如此，有研究提示转化生长因子β1(TGF-β1)可以促进成纤维细胞FGF2生成，FGF2随后以自分泌的方式促进成纤维细胞增生，故有学者认为TGF-β1诱导肾间质纤维化的过程主要是由FGF2介导的。FGF2的生物学功能是通过与其受体FGFR(FGFR1-4)结合而实现的，其中FGFR1在肾脏组织高表达，但到目前为止，FGF2信号通路促肾间质纤维化中的作用和机制仍未完全阐明，而对FGF2/FGFR信号通路活性的有效调控可能是抑制肾间质纤维化的重要途径。 Klotho主要在肾小管上皮细胞表达，其分泌型蛋白是一种激素样物质，可以进入血液循环作为体液因子调节靶细胞功能，该基因敲除小鼠与慢性肾衰竭患者的表型及其相似，肾脏出现明显的间质纤维化。近年来，Klotho与肾脏疾病的关系引起了我们和其他学者的关注，许多研究证实Klotho可以保护肾脏功能，延缓肾脏衰老，但在CKD时，肾组织中Klotho表达水平却显著降低。值得关注的是，Klotho与成纤维细胞生长因子家族(FGFs)有着密切关联，Klotho蛋白的主要配体即是FGFs的受体FGFR，它可以与细胞表面所有1-4型的FGFR进行结合，并发挥调节FGFS信号通路的作用。Klotho结合FGFR后，可以显著促进FGF23，FGF19和FGF21与FGFR的结合，增强这些信号通路的活性；而对于FGF2，Klotho可与其竞争结合FGFR，并有可能因此抑制FGF2信号通路活性。我们推测，在正常情况下，机体内Klotho与FGF2信号通路之间可能处于相对平衡状态，但在CKD时，肾脏Klotho表达降低则有可能导致其对FGF2信号通路的抑制作用减弱，FGF2信号增强会诱导肾小管上皮细胞发生表型改变，成纤维细胞亦会增生、分化成为肌成纤维细胞，并过度生成ECM，最终导致肾间质纤维化。所以，Klotho对FGF2信号通路的调控可能在肾间质纤维化过程中发挥着及其重要的作用，对相关机制的深入研究将有助于进一步揭示肾间质纤维化的发生机理，并为寻找有效的防治措施提供理论依据。 为此，本课题以肾小管上皮细胞(HK-2)和肾成纤维细胞(NRK-49F)为体外研究对象，并利用FGF2基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠制备单侧输尿管梗阻模型，分为以下三个部分对Klotho调控FGF2/FGFR信号通路在肾间质纤维化中的作用及机制进行了研究：(1)首先明确FGF2诱导肾小管上皮细胞重塑和成纤维细胞增生、分化的作用及可能机制，观察Klotho是否可以通过调控FGF2信号通路抑制FGF2的上述作用，并分析两者之间的相互影响；(2)评价FGF2基因敲除小鼠制备单侧输尿管梗阻模型后Klotho表达和肾间质纤维化情况，进一步证实FGF2信号通路在肾间质纤维化中的重要作用；(3)制备单侧输尿管梗阻模型小鼠，通过外源性给予Klotho，进一步探讨Klotho对FGF2/FGFR信号通路和肾间质纤维化的抑制作用。 主要研究结果及结论如下： 1. FGF2诱导肾小管上皮细胞重塑的同时Klotho表达下调： 人近曲小管上皮细胞HK-2经重组人FGF2蛋白处理48h后，出现一系列表型改变，如细胞变长、分叉，失去原来的鹅卵石样形态，且具有剂量依赖性。Western blot检测发现FGF2可剂量依赖性的诱导HK-2细胞上皮标志物E-cadherin表达降低，而肌成纤维细胞标志物α-SMA和FSP-1表达上调，这说明HK-2细胞经历了从小管上皮细胞表型向致纤维化的肌成纤维细胞表型转化。与此同时，FGF2处理HK-2细胞后，Klotho mRNA及蛋白水平均明显下降并呈剂量依赖性，提示小管上皮细胞发生重塑的同时Klotho在该细胞的表达亦会显著下调。 2. FGF2诱导的小管上皮细胞重塑与ERK1/2信号活化有关，并且Klotho可以抑制FGF2的作用和ERK1/2活化： Western blot检测发现，100ng/ml FGF2处理HK-2细胞5-10min后磷酸化的FRS2α(ERK1/2上游基因)及ERK1/2表达明显增高，而ERK1/2抑制剂U0126(20μM)预孵育可显著抑制FGF2诱导的E-cadherin表达降低及α-SMA和FSP-1表达上调。提示ERK1/2激活在FGF2诱导小管上皮细胞重塑过程中发挥着重要作用。而200pM和400pM的重组人Klotho蛋白预孵育30min可显著抑制FGF2诱导的FRS2α和ERK1/2活化，同时减弱了FGF2诱导E-cadherin表达降低及α-SMA和FSP-1表达上调的作用。免疫荧光染色进一步发现，Klotho蛋白预孵育可以抑制FGF2诱导的HK-2细胞cytokeratin表达减弱及vimentin表达增强。上述结果表明，ERK1/2信号活化可能介导了FGF2诱导的肾小管上皮细胞重塑，而Klotho蛋白可以显著抑制FGF2诱导小管上皮细胞重塑的作用。 3. Klotho抑制FGF2诱导小管上皮细胞重塑的作用是通过与FGF2竞争结合FGFR1而实现的 为了阐明Klotho抑制FGF2诱导小管上皮细胞重塑的可能机制，我们首先通过Western blot检测了Klotho对HK-2细胞FGF2表达的影响，结果发现400pM Klotho并不能直接抑制小管上皮细胞FGF2的表达，但却可以抑制TGF-β1诱导的FGF2表达上调。为了明确Klotho对FGF2诱导小管上皮细胞重塑的抑制作用是否是通过阻断TGF-β1信号而间接实现的，我们利用LY-364947(TGF-β1Ⅰ型受体ALK5的抑制剂)预孵育后再用Klotho和FGF2顺序孵育HK-2细胞，结果发现10μM的LY-364947预孵育并不影响Klotho对FGF2诱导的E-cadherin表达下调和α-SMA及FSP-1表达上调的抑制作用，说明Klotho对FGF2诱导小管上皮细胞重塑的抑制作用并不是通过干预TGF-β1信号通路而介导的。 鉴于Klotho与FGFs信号之间的关系，我们利用免疫共沉淀分析HK-2细胞中Klotho和FGF2与受体FGFR1的结合情况。结果发现，Klotho蛋白可以明显减弱FGF2和FGFR1的结合能力。由于Klotho可以增加FGF23与FGFR1的亲和力，而肾脏FGF23表达在CKD时明显增高，所以我们同时观察了FGF23、FGF2和Klotho共存时与FGFR1相互结合的情况，结果发现FGF23的存在并不能抑制甚至轻度增加了Klotho与FGF2竞争性结合FGFR1的能力。因此，这些研究结果证实Klotho抑制FGF2诱导小管上皮细胞重塑的作用可能是通过与其竞争结合FGFR1而实现的。 4. Klotho还可以抑制FGF2诱导的成纤维细胞增生及向肌成纤维细胞分化： 由于FGF2的另一重要效应是诱导成纤维细胞增生和分化，我们进一步观察了Klotho对FGF2诱导成纤维细胞增生与分化的影响。CCK-8检测结果发现，10ng/ml FGF2孵育72h可以显著诱导肾脏成纤维细胞NRK-49F增生，而400pM Klotho预孵育几乎可以完全阻断该效应。同时，Western blot检测提示FGF2诱导的肌成纤维细胞标志物α-SMA和ECM蛋白Fibronectin表达增高也可以被Klotho抑制。说明Klotho同样可以抑制FGF2诱导的成纤维细胞增生和分化。 5. FGF2基因敲除小鼠制备单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型后肾间质纤维化较野生小鼠明显减轻， Klotho表达下调和ERK1/2活化亦明显减弱： 为了明确FGF2在肾间质纤维化过程中的关键作用以及与Klotho的关系，我们采用FGF2基因敲除小鼠制备UUO模型进行了相关研究。结果发现，术后14天FGF2-/-小鼠梗阻侧肾脏的Klotho水平明显高于野生型小鼠，而ERK1/2信号活化却较野生型小鼠明显减弱；Masson染色发现，FGF2-/-小鼠的肾间质纤维化较野生型小鼠明显减轻；免疫化学和Western blot检测证实，与野生型UUO小鼠相比，FGF2-/-小鼠肾脏E-cadherin表达降低、α-SMA和Ki67双阳性染色的间质细胞数量增多及fibronectin表达增加均明显减轻。上述结果说明，FGF2在肾间质纤维化过程中扮演着重要角色，当该基因缺失时，肾间质纤维化明显减轻，同时Klotho表达降低和ERK1/2信号活化均明显减弱，提示FGF2信号通路活化与Klotho之间的相互影响可能是肾间质纤维化的重要因素。 6. UUO模型小鼠Klotho表达明显降低，而FGF2表达显著增加；Klotho蛋白腹腔注射可以明显减轻UUO小鼠肾间质纤维化并抑制FGF2信号通路活化： 为了进一步明确FGF2在肾间质纤维化中的关键作用以及Klotho与FGF2的相互关系，我们首先检测了C57BL/6J小鼠UUO模型肾间质纤维化过程中Klotho及FGF2表达变化，结果发现UUO术后梗阻侧肾脏Klotho水平逐渐下降，并且在术后第14天时降低最明显，而梗阻侧肾脏FGF2表达则在术后第7天和第14天明显上升。此结果提示，Klotho表达降低和FGF2表达升高的确与肾间质纤维化密切相关。 为了阐明Klotho是否可以抑制肾间质纤维化，在本研究中，UUO模型小鼠术后立即给予不同剂量的重组小鼠Klotho蛋白(0.01mg/kg/48h和0.02mg/kg/48h)腹腔注射，结果发现UUO小鼠术后14天梗阻侧肾脏α-SMA及fibronectin mRNA表达较假手术组明显升高，而两种剂量的Klotho蛋白腹腔注射均可抑制α-SMA及fibronectin mRNA表达上调，0.02mg/kg/48h Klotho蛋白组的作用略强，但UUO模型注射0.01mg/kg Klotho蛋白组与UUO模型注射Vehicle(注射同等体积的0.01M PBS)组相比，α-SMA及fibronectin表达已显著下调，故后续实验小鼠均选择0.01mg/kg/48h Klotho蛋白腹腔注射。 肾脏HE和Masson染色证实，Klotho可以明显改善梗阻侧肾脏的病变程度和间质纤维化。同时，免疫化学染色和Western blot检测提示Klotho腹腔注射明显抑制了UUO模型小鼠肾组织E-cadherin的表达降低、α-SMA和Ki67免疫荧光双染阳性的间质细胞增多以及fibronectin表达增高。不仅如此，我们还发现Klotho腹腔注射能够显著降低UUO小鼠梗阻侧肾脏中FGF2的表达以及FRS2α和ERK1/2的活化。上述结果证实Klotho腹腔注射可以显著抑制UUO模型小鼠的肾间质纤维化，减轻小管上皮细胞重塑、间质成纤维细胞增生以及ECM蛋白积聚，其作用可能与抑制了FGF2信号通路活化有关。 综上所述，我们的研究结果提示，FGF2可以通过诱导肾小管上皮细胞重塑和成纤维细胞增生和分化促进肾间质纤维化，其诱导小管上皮细胞重塑的作用可能与ERK1/2活化有关；而Klotho可以通过与FGF2竞争结合FGFR1抑制FGF2信号通路活性，从而改善肾间质纤维化。但在肾间质纤维化过程中，，随着肾小管上皮细胞重塑的发生，Klotho的表达却明显降低，而外源性补充Klotho或上调Klotho表达则可以显著阻遏肾间质纤维化的进展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692
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